間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基治療肝氧化應(yīng)激損傷中部分miRNA的變化*

徐雪晶， 李 棟， 李 雪， 鞠秀麗△

(1山東大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518057； 2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院兒科，山東 濟南 250012)

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間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基治療肝氧化應(yīng)激損傷中部分miRNA的變化*

徐雪晶1， 李 棟2， 李 雪2， 鞠秀麗2△

(1山東大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518057；2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院兒科，山東 濟南 250012)

目的： 研究采用人臍帶間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基(MSC-CM)治療肝細胞氧化應(yīng)激損傷中微小RNA(miRNA)的差異性表達并探討其調(diào)控機制。方法: 制備人正常肝細胞株L02氧化應(yīng)激損傷模型，體外分離培養(yǎng)健康人臍帶間充質(zhì)干細胞并制備MSC-CM。損傷模型經(jīng)MSC-CM治療，用凋亡、細胞活力、細胞周期及線粒體膜電位等實驗驗證其治療效果。定量RT-qPCR篩選差異性表達miRNA。應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測其靶蛋白后使用Western blot實驗驗證。結(jié)果：MSC-CM 治療可以顯著減少H2O2氧化應(yīng)激損傷所致的細胞凋亡比率，增加細胞活力，調(diào)節(jié)細胞周期。經(jīng)RT-qPCR篩選出顯著差異表達的miR-143、miR-145、miR-301a與let-7a，均在損傷后表達升高，而在MSC-CM作用后表達降低。Western blot實驗結(jié)果顯示miR-143的預(yù)測靶蛋白HK2和ADRB1的表達在肝細胞損傷后降低，MSC-CM作用后升高，與miR-143調(diào)控趨勢一致。結(jié)論：MSC-CM治療可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)miRNA及其靶蛋白逆轉(zhuǎn)H2O2所致肝細胞氧化應(yīng)激損傷。

肝細胞； 氧化應(yīng)激損傷； 間充質(zhì)干細胞； 微小RNA

肝細胞氧化應(yīng)激損傷是肝臟疾病中常見的病理生理過程，常規(guī)治療手段為藥物干預(yù)，療效欠佳，如何預(yù)防和修復(fù)肝細胞氧化應(yīng)激損傷是亟需解決的問題。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)為肝細胞氧化應(yīng)激損傷的防治提供了一個新的治療策略。MSC的作用機制與其旁分泌某些化學(xué)物質(zhì)密切相關(guān)，如HGF、 IGF-1、 EGF、VEGF、 bFGF與TGF-β等。研究證實MSC通過改變微小RNA(microRNA, miRNA)的表達進而參與氧化應(yīng)激損傷細胞的修復(fù)[1-2]。miRNA與氧化應(yīng)激損傷修復(fù)的發(fā)生、發(fā)展、臨床表現(xiàn)和預(yù)后有密切聯(lián)系[3]。基于本實驗室前期[4]就MSC對肝硬化大鼠治療機制所行miRNA微陣列基因芯片的雜交分析結(jié)果篩選了21種顯著差異性表達的miRNA，用RT-qPCR驗證并篩選出高敏感性高特異性、差異表達顯著的4種miRNA(miR-143、miR-145、miR-301a與let-7a)。本文研究了間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基(mesenchymal stem cell-conditioned medium，MSC-CM)在修復(fù)肝細胞氧化應(yīng)激損傷過程中，miR-143、miR-145、miR-301a與let-7a及其潛在靶基因表達的變化，并探討了miRNA在肝臟氧化應(yīng)激損傷中可能的調(diào)控機制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

αMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基均購自HyClone；胎牛血清為Gibco產(chǎn)品；凋亡檢測Annexin V/碘化丙啶(propidium iodide，PI)試劑盒、線粒體膜電位JC-1檢測試劑盒購自BD；CCK-8檢測試劑盒購自Dojindo；細胞周期測定PI檢測試劑盒購自康為公司；miRNA提取試劑盒、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green熒光定量試劑盒購自北京天根生化科技公司，其中21種miRNA引物和內(nèi)參U6由該公司合成；抗人GAPDH、HK2、DAB2、NR2C2、ESR2、Bax和Bcl-2的抗體與 II 抗購自Proteintech；抗人ADRB1和BMF的抗體購自Abcam。

2 主要方法

2.1 臍帶MSC的分離、培養(yǎng)與條件培養(yǎng)基的制備 足月正常分娩的臍帶取自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科(產(chǎn)婦均知情同意)。臍帶MSC的分離、培養(yǎng)、鑒定[4]與條件培養(yǎng)基的制備參見本實驗室已發(fā)表的論文[5]。

2.2 肝細胞氧化應(yīng)激損傷模型的制備與實驗分組 人正常肝細胞株L02(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院低溫醫(yī)學(xué)實驗室保存)經(jīng)1 mmol/L H2O2作用3 h建立氧化應(yīng)激損傷細胞模型[5]，換置20% MSC-CM繼續(xù)培養(yǎng)6 h、24 h和48 h[5]。實驗分為對照組(control)、H2O2組和H2O2+ MSC-CM組。利用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度(A)值，計算MSC-CM作用后各個時點對受氧化應(yīng)激損傷肝細胞的細胞活力的影響，選擇合適的時點用于后續(xù)實驗。H2O2與H2O2+ MSC-CM組參考本實驗室前期研究[5]，為保證結(jié)果的準確性，所有實驗重復(fù)5次以上。

2.3 凋亡的定量測定 收集3組細胞，預(yù)冷無菌PBS沖洗，1 000 ×g離心5 min，計數(shù)并用1×binding buffer調(diào)整細胞密度為1 × 109/L，取100 μL，加入5 μL Annexin V、5 μL PI，混勻，室溫避光孵育15 min，加200 μL 1×binding buffer混勻，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡比例。

2.4 細胞周期的測定 收集105～106個細胞，預(yù)冷PBS沖洗2遍，95%乙醇固定過夜，1 000×g離心5 min，棄上清，用PBS沖洗2遍后加入400 μL PI染色液，37 ℃避光溫浴30 min。流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布情況，應(yīng)用Incyte軟件分析數(shù)據(jù)。

2.5 線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的測定 收集105～106個細胞，PBS沖洗2遍,加入500 μL JC-1工作液，37 ℃避光孵育15 min，1 000×g離心5 min，加入1×assay buffer 2 mL洗滌2次，離心棄上清，加入500 μL 1×assay buffer 重懸，使用流式細胞儀檢測細胞去極化比例。

細胞凋亡、周期與MMP測定均采用Guava EasyCyte 8HT流式細胞儀(Millipore)與Guava Incyte V 2.6(Millipore)軟件分析。2.6 細胞活力的測定 取對數(shù)生長期的L02細胞以每孔5 × 103細胞接種于96孔板，1 mmol/L H2O2作用3 h后，加入MSC-CM 作用24 h(根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果選取)，每孔(設(shè)置3個復(fù)孔)分別加10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h。酶標(biāo)儀測定各實驗組肝細胞在波長為450 nm 處的A值，利用各時刻生長抑制率研究MSC-CM對肝細胞氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)程度。

2.7 miRNA的提取和RT-qPCR 富集miRNA提取按miRNA提取試劑盒說明書操作。基于本實驗室前期MSC對肝硬化大鼠模型拯救機制的miRNA微陣列基因芯片雜交分析結(jié)果篩選了21種顯著差異性表達的miRNA，用RT-qPCR驗證篩選高敏感性高特異性的miRNA。0.25 μg的富集miRNA加入20 μL miRNA逆轉(zhuǎn)錄體系[采用miRNA 3’ 末端加多聚A尾ploy(A)，使用Oligo(dT)-universal tag通用逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最終生成miRNA對應(yīng)的cDNA第一鏈]。cDNA在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行SYBR Green熒光定量PCR檢測(試劑盒提供通用下游引物)。引物設(shè)計參考miRBase。實驗設(shè)3個復(fù)孔，軟件分析其Ct值，以U6作為內(nèi)參照，由公式2-ΔΔCt計算miRNA在氧化應(yīng)激損傷與MSC-CM拯救過程中的相對表達量。

2.8 miRNA靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測 采用miRBase(http://www.mirbase.org/)、 TargetScan(http://www.targetscan.org/)和 PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)3個在線分析軟件預(yù)測miRNA的靶基因。

2.9 Western blot法驗證靶基因與凋亡相關(guān)蛋白的表達 收集3組L02細胞，提取總蛋白，根據(jù)內(nèi)參照GAPDH定量結(jié)果對各蛋白樣本上樣量校正定量。通過SDS-PAGE進行檢測。本操作對MSC-CM逆轉(zhuǎn)肝細胞氧化應(yīng)激損傷過程中定量驗證miRNA下游靶基因和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、 BMF的變化，所有實驗重復(fù)5次以上。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Tukey檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)制圖采用Graphpad Prism6軟件。

結(jié) 果

1 MSC-CM對肝細胞氧化應(yīng)激損傷致凋亡的影響

1.1 Annexin V/PI雙染實驗結(jié)果 對照組、H2O2組和H2O2+ MSC-CM組的凋亡率分別為11.04%±0.48%、31.60%±1.07%和15.58%±0.55%；活細胞比例分別為82.87%±3.01%、65.69%±2.91%和82.00%±3.11%；與H2O2組相比， MSC-CM能減少H2O2誘導(dǎo)的細胞凋亡，增加活細胞比例，上述差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖1A。

Figure 1.MSC-CM reduced the apoptosis of L02 cells with oxidative stress injury. A: typical protective effect of MSC-CM on the apoptosis of L02 cells induced by H2O2examined by Annexin V/PI double staining and flow cytometryic analysis; B: MSC-CM protected L02 cells from MMP depolarization observed by JC-1 staining and flow cytometryic analysis. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖1 MSC-CM逆轉(zhuǎn)肝細胞氧化應(yīng)激損傷所致的細胞凋亡

1.2 肝細胞MMP的變化 JC-1染色示去極化的細胞比例對照組為2.60%±0.12%，H2O2組為20.20%±0.93%，H2O2+ MSC-CM組為5.06%±0.21%。H2O2+ MSC-CM組早期凋亡的比例顯著低于H2O2組，上述差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖1B。

1.3 肝細胞凋亡相關(guān)蛋白的變化 Western blot實驗結(jié)果表明，Bcl-2在H2O2處理L02細胞后蛋白表達下調(diào)，Bax和BMF蛋白表達上調(diào)；MSC-CM作用后，Bcl-2蛋白表達增加，Bax和BMF蛋白表達下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05),見圖2。

Figure 2.The expression levels of apoptosis-related proteins in the L02 cells detected by Western blot. In H2O2- treated L02 cells, the expression level of Bax and BMF proteins increased, while the expression level of Bcl-2 decreased. In MSC-CM-treated L02 cells, the expression levels of BAX and BMF proteins decreased, while the expression level of Bcl-2 increased. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖2 MSC-CM逆轉(zhuǎn)肝細胞氧化應(yīng)激損傷中凋亡相關(guān)蛋白的表達

2 細胞周期和細胞毒性的檢測結(jié)果

CCK-8實驗結(jié)果顯示氧化應(yīng)激損傷降低細胞活力，MSC-CM 作用6 h、24 h和48 h后，細胞活力明顯上升，上述差異均具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖3。與對照組相比，H2O2組G1期的細胞比例降低，S+G2期升高，而H2O2+ MSC-CM組的上述變化發(fā)生逆轉(zhuǎn)(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.MSC-CM regulated the viability of L02 cells under the condition of oxidative stress injury. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖3 MSC-CM通過提高細胞活性參與氧化應(yīng)激損傷的肝細胞的修復(fù)

3 在H2O2氧化應(yīng)激損傷與MSC-CM處理過程中miRNA的變化，RT-qPCR的驗證與miRNA靶基因的預(yù)測

經(jīng)miRNA微陣列基因芯片分析和 RT-qPCR分析，篩選4種在氧化應(yīng)激損傷與MSC-CM作用過程中高敏感性、高特異性、有顯著差異性表達的miRNA(miR-143、miR-145、miR-301a與let-7a)。上述miRNA在細胞氧化損傷后升高，MSC-CM作用后降低(圖5)。生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-143的靶基因為己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)和β1-腎上腺素受體(β1-adrenoreceptor，ADRB1)，miR-145的靶基因為Disabled homolog 2 (DAB2)，miR-301a的靶基因為nuclear receptor subfamily 2 group C member 2(NR2C2)，let-7a的靶基因為雌激素受體2(estrogen receptor 2，ESR2)。

4 H2O2氧化應(yīng)激損傷與MSC-CM處理后肝細胞靶蛋白的變化

Western blot實驗檢測結(jié)果表明，H2O2處理L02細胞后，HK2、ADRB1、DAB2、NR2C2與ESR2的蛋白表達下調(diào)；而MSC-CM作用后，上述蛋白表達均增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖6。

Figure 4.MSC-CM regulated cell cycle of the L02 cells with oxidative stress injury. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖4 MSC-CM通過調(diào)節(jié)細胞周期參與氧化應(yīng)激損傷肝細胞的修復(fù)

Figure 5.The effects of MSC-CM on the differential expression of miRNAs in the L02 cells with H2O2- induced oxidative stress injury as validated by RT-qPCR. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖5 RT-qPCR驗證miRNA在氧化應(yīng)激損傷與MSC-CM處理過程中的差異性表達

討 論

間充質(zhì)干細胞的應(yīng)用為氧化應(yīng)激損傷提供了新的治療策略。MSC通過分泌多種生長因子、細胞因子及其趨化因子調(diào)節(jié)細胞和組織活性進而參與氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)[6-9]。研究證實MSC-CM通過調(diào)節(jié)miRNA參與H2O2所致的肝細胞氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)。miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的約22 nt大小非編碼RNA分子, 通過與靶基因mRNA的結(jié)合調(diào)控其它基因mRNA和蛋白的表達, 參與細胞代謝[10]。本研究發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激損傷與MSC-CM修復(fù)進程中，miR-143、miR-145、miR-301a與let-7a均呈損傷后升高，MSC-CM作用后降低，差異性表達顯著。

miR-143在腫瘤中低表達，研究證實其通過調(diào)節(jié)靶基因KRAS、c-MYC和EBK5等，抑制細胞增殖， 促進細胞凋亡。HK2是糖酵解途徑的第一個限速酶，催化己糖磷酸化，HK2還可拮抗線粒體途徑的細胞凋亡。在供氧充足條件下，肝癌細胞比正常肝細胞糖酵解代謝活躍，糖酵解明顯增強， 即有氧糖酵解[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-143可能通過HK2調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激損傷過程中的細胞代謝，即經(jīng)H2O2誘導(dǎo)，相關(guān)代謝酶活性降低，細胞代謝降低，在供氧充足條件下加入MSC-CM，因富含細胞活性因子[5-8]，發(fā)生類似腫瘤細胞的有氧糖酵解，促進代謝與氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)。β1-腎上腺素受體通過活化蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，增強鈣調(diào)蛋白激酶 II(calmodulin kinase II，CaMKII)和核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的表達，增強caspase-8/9的活性，促進脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)所致細胞凋亡；ADRB1也可通過調(diào)節(jié)TNF-α和IL-6的表達，影響細胞炎癥的進展[12]。本研究中ADRB1損傷后表達降低，可能與機體自身調(diào)節(jié)抑制細胞凋亡有關(guān)；ADRB1在多巴酚丁胺停用期間抑制骨細胞凋亡[13]，本實驗中MSC-CM作用后ADRB1表達輕度上升，可能與細胞微環(huán)境相關(guān)，機制仍需深入探討。

Figure 6.The expression of miRNA target proteins in H2O2- and/or MSC-CM-treated L02 cells detected by Western blot analysis.Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH2O2group.

圖6 miRNA在氧化應(yīng)激損傷與MSC-CM處理過程中相關(guān)靶蛋白的變化

NR2C2又稱睪丸孤核受體4(testicular orphan nuclear receptor 4，TR4)，編碼核激素受體家族蛋白，該家族成員參與細胞代謝、分化與體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。Li等[14]指出TR4 作為FOX3a下游途徑調(diào)節(jié)因子參與氧化應(yīng)激損傷進程。研究指出TR4通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)核苷酸切除修復(fù)(transcription-coupled nucleotide excision repair，TC-NER)DNA修復(fù)途徑保護細胞免受電離輻射所致的氧化應(yīng)激損傷[15]。Kim等[16]提出TR4 通過調(diào)節(jié)Bcl-2的表達調(diào)控凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷中NR2C2表達降低，MSC-CM作用后表達升高，升高的NR2C2可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白及其DNA損傷的修復(fù)對抗細胞氧化應(yīng)激損傷。DAB2通過綁定生長因子受體結(jié)合蛋白2競爭性結(jié)合SOS進而調(diào)節(jié)生長因子/Ras途徑。DAB2參與Wnt 信號通路[17]和促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路[18]。本研究發(fā)現(xiàn)H2O2損傷后DAB2表達降低，MSC-CM作用后表達升高。在氧化應(yīng)激損傷與修復(fù)中miR145通過調(diào)節(jié)DAB2參與上述進程。ESR2編碼雌激素受體家族蛋白和核受體超家族轉(zhuǎn)錄因子。Kabir等[19]證實ESR通過MEK/ERK/GSK-3β通路誘導(dǎo)缺血/再灌注損傷心肌細胞的修復(fù)。本研究經(jīng)MSC-CM作用后，ESR2的表達顯著上升，MSC-CM可能通過上調(diào)的ESR2增強氧化應(yīng)激損傷肝細胞的自我修復(fù)。

綜上所述，MSC-CM可能通過調(diào)節(jié)凋亡、周期與相關(guān)miRNA等參與肝細胞氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)。miR-143通過調(diào)控預(yù)測靶蛋白HK2、ADRB1，調(diào)節(jié)糖酵解與炎癥因子的活性，參與肝細胞氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)。此外，miR-145、miR-301a和let-7a通過調(diào)控預(yù)測靶蛋白DAB2、NR2C2和ESR2調(diào)節(jié)FOX3a途徑、DNA修復(fù)、Wnt信號通路和MAPK等信號通路構(gòu)建一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控細胞氧化應(yīng)激損傷的修復(fù)。參與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的其它環(huán)節(jié)與具體調(diào)控機制仍需后續(xù)深入研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

MicroRNA expression in hepatocytes with hydrogen peroxide-induced oxidative stress-injury and alleviating effect of mesenchymal stem cell-conditioned medium

XU Xue-jing1, LI Dong2, LI Xue2, JU Xiu-Li2

(1ShenzhenResearchInstituteofShandongUniversity,Shenzhen518057,China;2DepartmentofPediatrics,QiluHospital,ShandongUniversity,Jinan250012,China.E-mail:shellysdcn@hotmail.com)

AIM: To evaluate the changes of microRNA (miRNA) in hepatocytes during hydrogen peroxide-induced oxidative stress injury, and to observe the alleviating effect of mesenchymal stem cell-conditioned medium (MSC-CM) in this progress. METHODS: The hepatocyte oxidative stress injury model was established using hydrogen peroxide and human normal liver cell line L02. MSC-CM was prepared using centrifugation and filter. The effects of MSC-CM on hepatocyte injury were evaluated by apoptosis analysis, cell viability detection, cell cycle, and mitochondrial membrane potential (MMP). Twenty-one differentially expressed miRNAs were selected by gene chip hybridization, in which miR-143, miR-145, miR-301a and let-7a were confirmed by RT-qPCR. Bioinformatics software was utilized to predict target proteins of these miRNAs, and then the proteins were verified by Western blot.RESULTS: MSC-CM markedly attenuated hydrogen peroxide-induced oxidative stress injury by reducing apoptosis, promoting cell viability and regulating cell cycle. The expression of miR-143, miR-145， miR-301a and let-7a, indentified by RT-qPCR, increased under the condition of oxidative stress injury, while decreased after MSC-CM treatment. The expression of miR-143 predicted target proteins, HK2 and ADRB1, decreased under the hydrogen peroxide-exposure, while increased after MSC-CM treatment, which is consistent with the regulatory trend of miR-143. CONCLUSION: MSC-CM might attenuate hydrogen peroxide induced oxidative stress injury via inhibiting apoptosis and regulating some miRNA expression.

Hepatocyte; Oxidative stress injury; Mesenchymal stem cells; MicroRNA

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1000- 4718(2016)09- 1670- 07

2016- 04- 25

2016- 06- 27

深圳市科技研發(fā)基金知識創(chuàng)新計劃(No.JCYJ20140418115449178);山東省科技發(fā)展計劃(No.2014GSF118131&2013GSF11812);山東大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費資助項目(No.2014QLKY02&2014QY003-11)

△通訊作者 Tel: 0531-82169214; E-mail: shellysdcn@hotmail.com

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.023