阿托伐他汀對ApoE基因敲除小鼠血管外膜成纖維細胞表型的影響*

徐 芳， 劉 穎， 齊 潔， 石 磊， 胡業佳， 王蔚琛， 蔡虹靜， 劉 巍， 李鈺伶

(1濱州醫學院病理生理學教研室，山東 煙臺 264003；2濱州醫學院附屬醫院，山東 濱州 256603)

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阿托伐他汀對ApoE基因敲除小鼠血管外膜成纖維細胞表型的影響*

徐 芳1△， 劉 穎2， 齊 潔2， 石 磊1， 胡業佳1， 王蔚琛1， 蔡虹靜1， 劉 巍1， 李鈺伶1

(1濱州醫學院病理生理學教研室，山東 煙臺 264003；2濱州醫學院附屬醫院，山東 濱州 256603)

目的： 觀察載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成過程中血管外膜α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和轉化生長因子-β1(TGF-β1)的表達變化，同時探討阿托伐他汀抗動脈粥樣硬化的作用機制。方法: 選擇40只6周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機分為模型組和阿托伐他汀干預組，給予高脂飼料喂養。阿托伐他汀干預組給予阿托伐他汀(20 mg·kg-1·d-1)灌胃，模型組給予等量生理鹽水灌胃。20只同齡C57BL/6小鼠給予普通飼料喂養作為正常對照組。各組小鼠喂養至10、15周齡，在各個時點處死動物，取升主動脈制備連續切片，通過Movat染色進行形態學觀察，測量并計算血管外膜厚度及斑塊相對面積；天狼星紅染色檢測膠原的表達；免疫組織化學染色檢測不同時點血管外膜α-SMA及TGF-β1的表達變化。用實時熒光定量PCR檢測胸主動脈外膜中TGF-β1 mRNA的表達水平，通過Western blot 法檢測主動脈外膜中TGF-β1蛋白的表達。結果: 與模型組相比，阿托伐他汀干預組的斑塊相對面積明顯減小，血管外膜厚度及膠原合成明顯下降；免疫組化結果顯示 15周齡模型組血管外膜α-SMA及TGF-β1的表達高于10周齡模型組；與模型組相比，阿托伐他汀干預組血管外膜α-SMA及TGF-β1的表達明顯下降。各時點模型組的TGF-β1 mRNA和蛋白的表達明顯高于對照組，給藥干預后TGF-β1 mRNA和蛋白的表達明顯降低。15周齡模型組血管外膜TGF-β1 mRNA和蛋白的表達高于10周齡模型組。結論: 阿托伐他汀可能通過下調TGF-β1的表達調控血管外膜成纖維細胞表型的改變，進而延緩ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的進程。

ApoE-/-小鼠； 動脈粥樣硬化； 成纖維細胞； 表型； 阿托伐他汀

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是多種原因引起的由一系列復雜分子和細胞參與的病理過程，長期以來AS一直是心血管疾病發生的最主要的病理基礎。但是血管外膜在AS中的作用被長期忽視，外膜曾一度被認為只是血管外周一層松散的結締組織，是血管外層無功能的包裹物[1]。然而越來越多的實驗證據提示血管外膜可以通過組織學、生物化學和功能特性的改變直接或間接地來調節血管對損傷和應激的反應能力，在維持整個血管系統的動態平衡中發揮著重要作用[2-4]。成纖維細胞作為外膜最主要的細胞成分，在應對炎癥、環境應激(如缺氧、缺血)和損傷等的反應中往往是最先被激活[5-6]。

許多研究發現他汀類除調脂作用外，還具有改善血管內皮細胞功能、抗炎、抗氧化、抑制血管平滑肌細胞增生等其它作用[7]。但是關于他汀對血管外膜作用的報道甚少，本研究擬觀察阿托伐他汀對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成過程中血管外膜 α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表達的影響，探討阿托伐他汀抗動脈粥樣硬化的作用機制。

材 料 和 方 法

1 動物和試劑

6周齡ApoE-/-雄性小鼠和C57BL/6小鼠均購自北京大學醫學部實驗動物中心,合格證編號為SCXK(京)2011-0012。

阿托伐他汀由美國輝瑞公司惠贈，用0.9%氯化鈉溶解；抗小鼠vimentin抗體、抗小鼠α-SMA抗體均購于NeoMarkers；免疫組化試劑盒購自福州邁新試劑公司；兔多克隆抗TGF-β1抗體購自Santa Cruz；即用型SP免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物技術公司；鏈霉親和素-生物素-cy3(strept avidin-biotin complex-cy3，SABC-cy3) 試劑盒購于武漢博士德公司；TRIzol、反轉錄試劑盒、SYBR?Green熒光定量PCR試劑盒購于大連寶生物公司。

2 方法

2.1 動物分組 選取40只6周齡雄性ApoE-/-小鼠給予高脂飼料喂養(78.85%基礎飼料+21%脂肪+0.15%膽固醇)，隨機分為模型組(生理鹽水，0.1～0.2 mL，ig)和阿托伐他汀干預組(阿托伐他汀，20 mg·kg-1·d-1，ig)，每組20只。同齡C57BL/6雄性小鼠作為正常對照組，給予普通飼料喂養。

2.2 標本處理 每組小鼠喂養至10周齡和15周齡，各取10只在各個時點處死動物，無菌條件下將心臟在升主動脈水平分離出來，將心臟從左右心耳底緣1～2 mm處水平分開，4%多聚甲醛固定后石蠟包埋制備連續切片，用于Movat染色、天狼星紅染色及免疫組化染色。分離胸腹主動脈，解剖顯微鏡下剝離外膜，-80 ℃ 凍存。

2.3 Movat染色 步驟參照文獻[8]進行。由圖像分析系統Image Pro Plus 6.0測算斑塊面積與血管管腔面積相對比值，測量血管外膜厚度。

2.4 天狼星紅染色 部分切片經天狼星紅染色后在偏振光顯微鏡下觀察拍照，Image-Pro Plus 6.0測定膠原所占面積。

2.5 免疫組織化學染色 選取部分切片進行免疫組織化學染色檢測α-SMA和vimentin的表達，按組織免疫組化試劑盒說明書進行操作。部分切片通過免疫熒光染色檢測TGF-β1的表達，按SABC-cy3試劑盒說明書進行操作，顯微鏡下觀察采集圖像，由圖像分析系統Image Pro Plus 6.0分析平均光密度值。

2.6 實時熒光定量PCR 采用TRIzol兩步法抽提胸腹主動脈外膜的總RNA；反轉錄按照TaKaRa的反轉錄試劑盒進行。10 μL反應體系為RNA 2 μL、5×PrimeScript buffer 2 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL、Oligo dT Prime 0.5 μL、Random 6 mers 0.5 μL，去RNA酶水 4.5 μL。反應條件為37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，1個循環后得到的cDNA于-20℃保存備用。熒光定量PCR反應所用 GAPDH的上游引物序列為5′-AACTGCTTAGCACCCCTGGC-3′，下游引物序列為5′-ATGACCTTGCCCACACAGCCTT-3′；TGF-β1的上游引物序列為5′-CGTCAGACATTCGGGAAGC-3′，下游引物序列為5′-ACGTCAAAAGACAGCCACTC-3′。實時熒光定量PCR反應體系為SYBR?PrimeExTaq(Tli RNaseH Plus) 10 μL、PCR上游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，PCR下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL、ROX Reference Dye(50×)0.4 μL、DNA模板 2 μL、dH2O 6.8 μL；反應條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s， 共40個循環。反應結束，設定最佳閾值得到Ct值。用2-ΔΔCt法計算。實驗重復3次。

2.7 Western blot 法檢測蛋白表達水平 取各組小鼠胸腹主動脈外膜組織，提取蛋白后進行蛋白定量；進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉法將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜。 封閉液封閉2 h后，加入TGF-β1(1∶100)和β-actin(1∶1 000)I抗4 ℃過夜。洗膜液洗膜3次，洗膜后加入HRP標記的II抗(1∶2 500)37 ℃孵育1 h，然后洗膜液洗膜3次，ECL發光，曝光后掃描，以目的條帶和內參照β-actin的光密度比值表示TGF-β1蛋白的表達水平。

3 統計學處理

檢測結果以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，組間均數比較采用單因素方差分析，2組間樣本均數比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同周齡小鼠主動脈組織的形態學變化

C57BL/6小鼠主動脈壁厚薄均勻，內膜完整，無動脈粥樣硬化斑塊形成，血管外膜未見明顯病理變化。10周齡ApoE-/-小鼠模型組局部內膜增厚，并有泡沫細胞聚集；干預組內膜局部稍有增厚，少量泡沫細胞。15周齡ApoE-/-小鼠模型組主動脈內膜明顯增厚，局部可見腔內明顯凸起的纖維斑塊，干預組病變程度較模型組顯著減輕，見圖1。

Figure 1. The pathological changes of arterial tissues in each group. A: adventitia; L: lumen; W: weeks.

圖1 各組小鼠主動脈組織形態學觀察

2 不同周齡小鼠主動脈粥樣硬化斑塊的面積及外膜厚度的定量分析

10周齡模型組、阿托伐他汀干預組和正常對照組AS斑塊面積/管腔總面積分別為0.20±0.03、0.14±0.01和0，外膜厚度分別為(76.88±6.17) μm、(50.51±5.54) μm和(26.43±3.32) μm；15周齡模型組、阿托伐他汀干預組和正常對照組 AS 斑塊面積/管腔總面積分別為0.44±0.03、0.23±0.02和0，外膜厚度分別為(114.93±4.32) μm、(78.64±5.72) μm和(25.51±2.89) μm；與10周齡模型組比較，15周齡模型組斑塊面積/管腔總面積顯著增大(P<0.05)，外膜厚度增加(P<0.05)；同一時點小鼠斑塊面積/管腔總面積及外膜厚度相比較，阿托伐他汀干預組明顯小于模型組(P<0.05),見圖2、表1。

Figure 2.The changes of plaque area/lumen area in different groups. W: weeks. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsmodel;#P<0.05vs10 W.

圖2 各組小鼠不同周齡斑塊面積/管腔面積比值的比較

表1 各組小鼠血管外膜厚度及膠原合成的比較

W: weeks.*P<0.05vs10 W-control;#P<0.05vs15 W-control;&P<0.05vs10 W-model;$P<0.05vs15 W-model.

3 不同周齡小鼠主動脈的膠原合成比較

10周齡模型組、阿托伐他汀干預組與正常對照組血管外膜膠原所占面積分別為(357.88±5.69) μm2、(320.98±4.74) μm2、(115.29±3.42) μm2；15周齡模型組、阿托伐他汀干預組與正常對照組血管外膜膠原所占面積分別為(428.34±5.49) μm2，(349.70±4.36) μm2，(110.47±3.24) μm2，各模型組血管外膜膠原合成明顯高于對照組。與10周齡模型組比較，15周齡模型組血管外膜膠原合成明顯增加(P<0.05)，同一時點相比較，阿托伐他汀干預組外膜膠原合成明顯低于模型組(P<0.05),見圖3、表1。

4 不同周齡小鼠主動脈外膜α-SMA、vimentin及TGF-β1的表達水平

10周、15周ApoE-/-小鼠血管外膜大部分細胞呈現vimentin陽性表達, 部分細胞呈現α-SMA的陽性表達，顯示檢測細胞為成纖維細胞，并表現出轉化為肌成纖維細胞的特性。而C57BL/6小鼠血管外膜細胞只檢測到vimentin的陽性表達，始終未檢測到α-SMA的陽性表達。15周齡模型組血管外膜α-SMA及TGF-β1的表達高于10周齡模型組(P<0.05)；與模型組相比，阿托伐他汀干預組血管外膜α-SMA及TGF-β1的表達明顯下降(P<0.05),見圖4～6。

5 不同周齡小鼠主動脈外膜TGF-β1 mRNA的表達水平

各時點模型組TGF-β1 mRNA的表達明顯高于對照組(P<0.05)，阿托伐他汀干預后TGF-β1 mRNA的表達明顯降低(P<0.05)。15周齡模型組血管外膜TGF-β1 mRNA的表達高于10周齡模型組(P<0.05)，見圖7。

6 不同周齡小鼠主動脈外膜TGF-β1蛋白的表達水平

各時點模型組的TGF-β1蛋白的表達明顯高于對照組(P<0.05)，阿托伐他汀干預后TGF-β1蛋白的表達明顯降低(P<0.05)。15周齡模型組血管外膜TGF-β1蛋白表達高于10周齡模型組(P<0.05)，見圖8。

Figure 3.Sirius red staining for collagen fibers (×400). A: adventitia; L: lumen; W: weeks.

圖3 膠原合成的天狼星紅染色觀察

Figure 4. Immunohistochemical staining for vimentin (×400). A: adventitia; L: lumen; W: weeks.

圖4 Vimentin的免疫組化染色

Figure 5.The changes of α-SMA in the adventitia of different groups. A1: immunohistochemical staining for α-SMA (×400). A: adventitia; L: lumen. A2: the changes of α-SMA (quantitatively expressed as meanIAvalue) in the adventitia of different groups. W: weeks. Mean±SD.n=10.##P<0.01vs10 W;**P<0.01vsmodel.

圖5 比較各組小鼠主動脈外膜α-SMA的表達

討 論

長期以來血管內皮細胞損傷、血管平滑肌細胞增殖被認為在AS發生發展中起著關鍵作用，其中內皮細胞損傷是AS病灶形成的始動環節。而血管外膜特別是成纖維細胞的作用長期被忽視。隨著研究的進一步深入，越來越多的實驗證據顯示外膜可以通過由外而內的作用方式影響血管中膜及內膜，在AS病灶的形成和發展過程中，外膜不是無辜的旁觀者，而是積極的參與者。他汀類藥物是目前臨床上應用最廣泛的調血脂類藥物，多項研究發現除調脂作用外，他汀類還具有改善血管內皮細胞功能、抗炎、抗氧化、抑制血管平滑肌細胞增生等其它作用[7，9]，可以穩定AS斑塊[10]，降低心腦血管疾病的發生風險。但是關于他汀對AS病灶形成過程中血管外膜的作用尚少見報道。阿托伐他汀屬于3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，本研究擬觀察阿托伐他汀對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成過程中血管外膜α-SMA和TGF-β1表達的影響，探討阿托伐他汀抗動脈粥樣硬化的作用機制。

Figure 6.The changes of TGF-β1 in the adventitia of different groups. A1: immunofluorescence staining for TGF-β1 (×400). A: adventitia; L: lumen.A2: the changes of TGF-β1 (quantitatively expressed as meanIAvalue) in the adventitia of different groups. W: weeks. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol; #P<0.05vsmodel;△P<0.05vs10 W.

圖6 比較各組小鼠主動脈外膜TGF-β1的表達

Figure 7.The mRNA expression of TGF-β1 in different groups. W: weeks. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel;&P<0.05vs10 W.

圖7 各組小鼠主動脈外膜TGF-β1 mRNA的表達

Figure 8.The protein expression of TGF-β1 in different groups. W: weeks. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel;&P<0.05vs10 W.

圖8 各組小鼠主動脈外膜TGF-β1蛋白的表達

在面對各種損傷的反應過程中，外膜細胞可表現出不同的結構和功能行為的改變，表達多種血管活性因子，參與血管重塑。有研究證明在血管內皮損傷的動物模型中，血管外膜表現為明顯增厚，出現血管外膜成纖維細胞表型轉化成肌成纖維細胞聚集[11-12]。在移植性血管病動物模型中發現新生內膜增生之前外膜即出現大量α-SMA 陽性的肌成纖維細胞[13]。肌成纖維細胞非典型平滑肌細胞，是一類具有平滑肌細胞樣特點的成纖維細胞。成纖維細胞表型轉變為肌成纖維細胞后又可以通過合成膠原，分泌其它細胞外基質蛋白、趨化因子和生長因子[14]，釋放活性氧，進行大量增殖，并且能夠遷移到新生內膜中，促進內皮細胞和平滑肌細胞的增殖[15]，從而參與AS病灶的形成和發展。Zalewski等[16]報道冠狀動脈球囊成形術后外膜成纖維細胞首先出現增殖，隨后轉化為肌成纖維細胞并遷移到新生內膜。我們前期研究也發現ApoE-/-小鼠血管外膜成纖維細胞表現出最早最顯著的增殖活性， BrdU陽性標記細胞出現的次序提示外膜增殖的成纖維細胞向內膜遷移的可能性[17]。而且有研究發現辛伐他汀可以劑量依賴地抑制血管外膜成纖維細胞增殖、 遷移和膠原合成[18]。我們在本實驗中觀察了不同周齡ApoE-/-小鼠AS病灶形成過程中血管外膜成纖維細胞表型的變化。結果發現10周、15周的ApoE-/-小鼠血管外膜大部分細胞呈現vimentin陽性表達, 部分細胞呈現α-SMA的陽性表達，而且15周齡ApoE-/-小鼠血管外膜α-SMA的表達高于10周齡模型組，提示所檢測的細胞為成纖維細胞，并表現出轉化為肌成纖維細胞的特性。而C57BL/6小鼠血管外膜細胞只檢測到vimentin的陽性表達，始終未檢測到α-SMA的陽性表達。應用阿托伐他汀干預后發現，與模型組相比，干預組血管外膜α-SMA的表達明顯下降。干預組AS斑塊面積及外膜厚度較模型組減少，外膜膠原合成明顯減少，結果提示阿托伐他汀可以干預AS病灶形成過程中血管外膜成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，減少膠原的合成，從而減輕病灶的形成和發展。

成纖維細胞轉變為肌成纖維細胞是由一個非常復雜的微環境調節的，其中在血管外膜TGF-β1是一非常重要的血管外周生長因子，被公認為是影響外膜成纖維細胞生物功能最直接，也是最重要的細胞因子[19]。有研究發現在兔血管重塑的靜脈移植模型中TGF-β1促進了肌成纖維細胞的激活和遷移[20]。Ren等[21]在研究中也發現TGF-β1可促進大鼠胸主動脈外膜成纖維細胞向肌成纖維細胞轉變、增殖、合成膠原，其機制可能和Smad2/Smad3信號通路有關。我們在實驗中觀察到ApoE-/-小鼠隨著高脂喂養時間延長，主動脈外膜TGF-β1的表達增加，從而促使成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化。阿托伐他汀可以明顯減少ApoE-/-小鼠血管外膜TGF-β1的表達，結果提示阿托伐他汀可能通過減少TGF-β1的表達來抑制外膜成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化。

綜上所述，本研究發現AS形成過程中血管外膜成纖維細胞表型轉變為肌成纖維細胞，阿托伐他汀可以下調TGF-β1的表達，因此推測阿托伐他汀可能通過減少TGF-β1的表達來抑制外膜成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，從而減少膠原的合成，減輕AS病灶的形成和發展。我們將通過后續實驗進一步研究阿托伐他汀抑制外膜成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化的作用機制，為阿托伐他汀抗AS的作用提供更充實的實驗依據。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Effect of atorvastatin on adventitial fibroblast phenotype differentiation in atherosclerosis of apolipoprotein E-knockout mice

XU Fang1, LIU Ying2, QI Jie2, SHI Lei1, HU Ye-jia1, WANG Wei-chen1, CAI Hong-jing1, LIU Wei1, LI Yu-ling1

(1DepartmentofPathophysiology,BinzhouMedicalUniversity,Yantai264003,China;2AffiliatedHospital,BinzhouMedicalUniversity,Binzhou256603,China.E-mail:xufang1979@163.com)

AIM: To explore the effect of atorvastatin on the expression of α-SMA and TGF-β1 in the adventitia ofApoE-/-mice with atherosclerosis, and to investigate the underlying mechanism of atorvastatin therapy. METHODS: MaleApoE-/-mice (n=40) at 6-weeks of age were used to establish the atherosclerosis model by feeding with high fat diet. The mice were randomly divided into model group and atorvastatin group. In atorvastatin group, the mice were lavaged with atorvastatin at dose of 20 mg·kg-1·d-1. The mice in model group were given normal saline. C57BL/6 mice of the same age served as control group, feeding with ordinary food. The mice were respectively sacrificed at the time points of 10 and 15 weeks after feeding with different diets. The ascending aorta was removed for serial sectioning. Some sections were performed with Movat staining in order to observe the morphological changes of the tissues, and to measure the relative atherosclerotic plaque area and the thickness of the adventitia. Some sections were stained with Sirius red to identify the collagen synthesis. Immunohistochemistry assay was prepared to observe the expression of α-SMA and TGF-β1 in the adventitia at different time points. The expression of TGF-β1 at mRNA and protein levels in the thoracoabdominal aorta was measured by RT-qPCR and Western blot.RESULTS: Compared with model group, the formation of plaque in atorvastatin group significantly descended. Meanwhile the adventitial thickness and collagen synthesis also decreased. The results of immunohistochemical staining showed that compared with 10 weeks-model group, α-SMA and TGF-β1 in 15 weeks-model group was increased. The expression of α-SMA and TGF-β1 in atorvastatin group decreased significantly compared with model group. The expression of TGF-β1 at mRNA and protein levels in model group were higher than those in control group. They decreased in atorvastatin group compared with model group. Compared with 10 weeks-model group, the mRNA and protein of TGF-β1 in 15 weeks-model group were increased.CONCLUSION: Atorvastatin modulates adventitial fibroblast phenotype differentiation by suppressing expression of TGF-β1 and intervenes atherosclerotic development inApoE-/-mice.

ApoE-/-mice; Atherosclerosis; Fibroblasts; Phenotype; Atorvastatin

雜志網址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1599- 09

2016- 02- 22

2016- 05- 23

國家自然科學基金資助項目(No. 81401625)

△通訊作者 Tel: 0535-6913214; E-mail: xufang1979@163.com

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A

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