Fas過表達逆轉胃癌細胞順鉑耐藥*

陳 剛， 申屠楊萍

(1武警浙江總隊嘉興醫院腫瘤科, 浙江 嘉興 314000； 2溫州醫科大學機能實驗教學中心, 浙江 溫州 325000)

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Fas過表達逆轉胃癌細胞順鉑耐藥*

陳 剛1△， 申屠楊萍2

(1武警浙江總隊嘉興醫院腫瘤科, 浙江 嘉興 314000；2溫州醫科大學機能實驗教學中心, 浙江 溫州 325000)

目的： 探究Fas在胃癌細胞順鉑耐藥中的作用及可能的作用機制。方法: Western blot及RT-qPCR檢測胃癌細胞株SGC-7901及胃癌耐藥細胞株SGC-7901/DDP中Fas的表達情況。構建Fas過表達腺病毒載體,上調胃癌耐藥細胞株SGC-7901/DDP中Fas的表達，CCK-8檢測細胞活力,流式細胞術檢測細胞周期及細胞凋亡,Western blot法檢測Fas、P38/p-P38、JNK/p-JNK、cleaved caspase-8/caspase-8和cleaved caspase-3/caspase-3蛋白水平。結果: 耐藥細胞株SGC7901/DDP中Fas的mRNA及蛋白表達水平均明顯低于親本細胞株；并且在親本細胞株SGC7901中，Fas的蛋白表達水平隨著順鉑的濃度增加不斷降低。過表達Fas可抑制胃癌耐藥細胞SGC7901/DDP的細胞活力，并誘導其凋亡；同時上調p-P38、p-JNK、cleaved caspase-8和cleaved caspase-3的蛋白水平。結論: 胃癌順鉑耐藥細胞中過表達Fas可恢復細胞對順鉑的敏感性，促進細胞凋亡并抑制細胞生長，其機制可能與JNK和P38 MAPK信號通路的激活有關。

Fas； 胃癌； 順鉑耐藥； 細胞凋亡

胃癌是消化系統常見腫瘤之一，目前放、化療仍然是胃癌的主要治療方法。順鉑是第一個被發現的鉑類抗腫瘤藥物，可直接作用于DNA，引發腫瘤細胞凋亡，被廣泛應用于胃癌的治療[1]。但是，隨著化療藥物的大量應用，腫瘤細胞出現的耐藥性成為影響化療療效的主要因素。因此，有關逆轉腫瘤化療耐藥的研究具有重要的臨床意義。

研究表明腫瘤化療耐藥產生的機制可能有以下幾個方面[2-7]：(1) 包括P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)在內的ABC型膜載體介導的抗腫瘤藥物主動外排作用增強；(2) 多藥耐藥基因表達異常；(3) DNA損傷修復系統失調；(4) 細胞凋亡通路被阻礙。Fas是屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員的一種跨膜蛋白，它與FasL結合可以啟動凋亡信號的轉導引起細胞凋亡，在腫瘤監視過程中發揮重要作用。大量研究發現，在包括胃癌[8]、直腸癌[9]、乳腺癌[10]、肺癌[11]等多種實體腫瘤中都出現Fas的低表達或表達缺失，表明Fas在腫瘤的發生發展過程中起著重要的作用；同時有研究表明，TNF-α可通過NF-κB通路上調Fas的表達，進而提高順鉑對成神經細胞瘤的治療效果[12]，提示Fas在腫瘤化療耐藥中可能也發揮一定的作用。但是Fas在胃癌化療耐藥中的作用并沒有明確的闡釋。本文通過構建Fas過表達載體，系統研究了Fas在胃癌細胞順鉑耐藥中的作用及其相關機制。

材 料 和 方 法

1 材料

胃癌細胞株SGC-7901和胃癌耐藥細胞株SGC-7901/DDP均購買于中科院上海細胞庫；Ad-Fas腺病毒及病毒載體購買于上海和元生物有限公司；RPMI-1640培養基、胰蛋白酶購買于上海士鋒生物科技有限公司；CCK-8細胞計數試劑盒購買于廣州賴德生物技術有限公司；FBS胎牛血清購買于Gibco；乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒購買于江蘇碧云天生物技術研究所；Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購買于江蘇凱基生物技術股份有限公司；TRIzol和引物購買于Invitrogen；抗p-JNK/JNK、p-P38/P38抗體購買于Santa Cruz；抗cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-8/caspase-8、β-actin抗體和HRP標記抗兔II抗購買于江蘇碧云天生物技術研究所。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 將胃癌細胞株SGC-7901和胃癌耐藥細胞株SGC-7901/DDP培養于RPMI-1640培養基(含1.5 mmol/L L-谷氨酰胺、100 mL/L胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，并將細胞置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中進行培養。每隔1 d 換液1次，細胞生長達90%融合后可用0.25%胰酶消化后按1∶3的比例傳代。

2.2 實時熒光定量PCR檢測mRNA的表達 細胞總RNA的抽提采用TRIzol一步法(參照操作手冊)。取2 μg總RNA逆轉錄至終體積為20 μL，采用SYBR Green實時熒光定量PCR方法檢測mRNA的表達。用于定量多聚酶鏈反應的Fas正向引物為5’-GGACATGGCTTAGAAGTG-3’，反向引物為5’-GGTTGGAGATTCATGAGAACC-3’；β-actin的正向引物為5’-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3’，反向引物為5’-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3’。qPCR反應體系包括為1 μL逆轉錄產物，10 μL SYBR Green PCR Master Mix和500 nmol/L正、反向引物。采用MyiQ單色實時PCR檢測系統(Bio-Rad)，95 ℃ 30 min; 95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,循環40次。β-actin作為內參照，采用2-ΔΔCt法分析基因的相對表達量。

2.3 細胞對順鉑的敏感性檢測 首先，采用CCK-8的方法檢測胃癌細胞的半數抑制濃度。將處于對數生長期的細胞以1×108/L密度接種于96孔板中，待細胞長至90%融合進行同步化處理并加入終濃度分別為0、0.25、0.5、1、2、4、8和16 mg/L的順鉑，繼續培養48 h時，加入CCK-8 100 μL孵育2 h，測定450 nm波長處的吸光度值，計算細胞的生存率。其次，采用臺盼藍染色后血球計數板計數活細胞數量。取上述順鉑處理的細胞，胰酶消化后，冷PBS重懸2次，制備單個細胞懸液，適當稀釋后，向細胞懸液中加入0.4%臺盼藍溶液，使臺盼藍終濃度為0.04%，倒置顯微鏡下用血球計數板計數無染色的活細胞數量(死細胞被染成淡藍色)。

2.4 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性的測定 采用乳酸脫氫酶(LDH)相對活性變化檢測細胞毒性。將處于對數生長期的細胞以1×108/L密度接種于96孔板中，待細胞長至90%融合進行同步化處理并加入終濃度分別為0、0.25、0.5、1、2、4、8和16 mg/L的順鉑，繼續培養48 h。按照CytoTox 96?分析試劑盒實驗說明書定量地測量LDH在細胞裂解后的釋放量。記錄酶標儀下測定490 nm波長處的吸光度(A)值。LDH活性(%)=(處理組A值-空白對照A值)/(對照組A值-空白對照A值)× 100%。

2.5 Ad-Fas腺病毒載體的構建和轉染 腺病毒載體的構建參照文獻報道的方法[13]。Ad-Fas的制備按照 AdMax (Microbix)和pSilencerTMadeno 1.0-CMV System (Ambion)的說明書進行。線性化重組腺病毒質粒用HEK293A細胞進行包裝及擴增，經CsCl純化后，用含10%甘油的Tris緩沖液(20 mmol/L)進行透析，于-80 ℃保存。Ad-LacZ作為對照，用Western blot法檢測胃癌細胞轉染Ad-Fas腺病毒48 h后Fas的表達。

2.6 細胞凋亡的檢測 流式細胞術(Annexin V/PI雙染色法)檢測細胞凋亡，將各組細胞消化后1 000×g離心5 min，加入binding buffer重懸細胞。先加入Annexin V-FITC混勻后，室溫避光靜置10 min，后加PI染液，室溫下避光染色10 min，上機檢測，激發波長Ex=488 nm；發射波長Em=530 nm。

2.7 Western blot實驗 收集各實驗組蛋白樣品并用BCA試劑盒進行蛋白定量，調整各組上樣量后加入上樣緩沖液，98 ℃水浴變性5 min。8% SDS-PAGE電泳后電轉至PVDF膜(約90 min)，依照試劑盒說明用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入P38/p-P38、JNK/p-JNK、caspase-8/cleaved caspase-8、caspase-3/cleaved caspase-3及β-actin單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5 min 3次，分別加入抗HRP標記的II抗，室溫孵育1.5 h，TBST洗滌10 min 3次。于暗室中將PVDF膜的蛋白面浸入HRP-ECL發光液中激發熒光，壓X片、顯影并定影。

3 統計學處理

將數據錄入SPSS 13.0標準版統計軟件包行數據分析，所有實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，計量資料兩組之間的比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數間的兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Fas的表達與胃癌細胞順鉑耐藥之間的關系

我們首先檢測了胃癌順鉑耐藥細胞株SGC7901/DDP及其對照親本細胞株SGC7901的IC50[SGC7901/DDP：(5.51±0.23) mg/L;SGC7901：(0.62±0.02) mg/L]，結果證明SGC7901/DDP對順鉑的耐藥性明顯增強。同時我們同時檢測了這2株細胞Fas的mRNA及蛋白表達情況，耐藥細胞株SGC7901/DDP中Fas的mRNA及蛋白表達水平均明顯低于親本細胞株；在親本細胞株SGC7901中，Fas的蛋白表達水平隨著順鉑的濃度增加不斷降低。該結果提示Fas的表達可能與胃癌順鉑耐藥之間存在相關關系。并且，在親本細胞株SGC7901中，不同濃度順鉑處理細胞后，LDH活性沒有明顯變化，見圖1。

Figure 1.The relationship between Fas expression and cisplatin resistance in the stomach cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsSGC7901;#P<0.05vs0 mg/L group.

圖1 Fas的表達與胃癌細胞順鉑耐藥之間的關系

2 Fas過表達對耐藥細胞株SGC7901/DDP順鉑敏感性的影響

為進一步證明Fas的表達與胃癌順鉑耐藥之間的相互關系，我們在耐藥細胞株SGC7901/DDP中過表達Fas，并檢測其對順鉑耐藥性的變化，CCK-8實驗的結果顯示，SGC7901/DDP細胞過表達Fas后對順鉑的敏感性明顯增加，差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.Overexpression of Fas increased the sensitivity of the SGC-7901/DDP cells to cisplatin. Ctrl: control. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCtrl.

圖2 過表達Fas可提高耐藥細胞SGC7901/DDP對順鉑的敏感性

3 Fas過表達對細胞生物學行為的影響

接著我們觀察了Fas過表達對細胞活力的影響，結果顯示，在SGC7901/DDP中過表達Fas之后，細胞活力明顯降低(P<0.05)。細胞的凋亡情況檢測則發現，Fas過表達之后，耐藥細胞的凋亡明顯增加(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The effects of Fas overexpression on the viability (A) and apoptosis (B) of the SGC7901/DDP cells. Ctrl: control. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCtrl.

圖3 SGC7901/DDP細胞過表達Fas后的細胞活力和凋亡情況

4 Fas過表達對凋亡信號通路的影響

Western blot法檢測結果顯示SGC7901/DDP細胞過表達Fas之后，p-P38和p-JNK蛋白水平明顯增加(P<0.05)，而P38和JNK的表達無明顯變化，提示P38/JNK凋亡信號通路被激活。

除此之外，我們還檢測了caspase家族凋亡相關蛋白的表達情況。結果顯示，在SGC7901/DDP中過表達Fas之后激活型caspase-8和激活型caspase-3的蛋白水平增加，提示過表達Fas可誘導耐藥細胞中caspase家族凋亡相關蛋白的活化(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The effect of Fas on apoptosis-related pathway in the SGC7901/DDP cells. Ctrl: control. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsctrl.

圖4 Fas過表達對凋亡信號通路的影響

討 論

細胞增殖與凋亡的失平衡被認為是腫瘤化療耐藥發生的一個重要原因。在參與調控細胞凋亡的眾多信號轉導通路中，Fas/FasL通路是重要凋亡信號通路之一，參與腫瘤發生和發展[14]。我們的研究發現，在胃癌順鉑耐藥細胞株中Fas mRNA和蛋白的表達水平均顯著增加，提示Fas可能參與調控胃癌順鉑耐藥現象的發生。通過構建Fas過表達載體，我們發現在胃癌順鉑耐藥細胞SGC7901/DDP中過表達Fas可提高細胞對順鉑的敏感性。因此我們認為，Fas可逆轉胃癌順鉑耐藥。

為進一步了解Fas逆轉順鉑耐藥的作用機制，我們檢測了耐藥細胞SGC7901/DDP過表達Fas后，細胞的活力及凋亡水平。結果發現過表達Fas可促進SGC7901/DDP的凋亡，同時抑制細胞生長。由此我們認為Fas逆轉胃癌順鉑耐藥可能是通過抑制耐藥細胞生長和周期轉換，同時促進耐藥細胞凋亡來實現的。細胞凋亡是一個涉及多條信號通路、調控精細復雜的過程。Fas作為公認的凋亡受體蛋白，不僅可通過與FasL結合，激活死亡受體通路，誘導細胞凋亡；還可以激活JNK和P38 MAPK等促凋亡信號通路，使細胞對caspase介導的凋亡敏感性增加[15-17]。實驗中我們發現，Fas過表達可促進耐藥細胞中JNK及P38的磷酸化，激活JNK和P38信號通路；同時死亡蛋白酶caspase家族中2個關鍵的蛋白分子caspase-8和caspase-3被激活。Fas逆轉胃癌順鉑耐藥可能與凋亡信號通路的激活有關，但是除JNK和P38MAPK信號通路之外，是否還有其它通路的參與及其具體的調控機制還有待進一步的研究。

綜上所述，胃癌順鉑耐藥細胞中過表達Fas可恢復細胞對順鉑的敏感性，促進細胞凋亡并抑制細胞生長，其機制可能與JNK和P38 MAPK信號通路的激活有關。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

△ 通訊作者 Tel: 020-38274637； E-mail: zslyjohn@163.com

Role of Fas overexperssion in reversing cisplatin resistance in stomach cancer cells

CHEN Gang1, SHEN-TU Yang-ping2

(1DepartmentofOncology,ArmedPoliceCorpsofZhejiangJiaxingHospital,Jiaxing314000,China;2FunctionLaboratoryCentre,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:hg15868181011@163.com)

AIM: To study the effect of Fas on cisplatin resistance in stomach cancer cells and its possible mechanisms.METHODS: The expression of Fas at mRMA and protein levels in SGC-7901 cells and SGC-7901/DDP cells was determined by RT-qPCR and Western blot. Fas-containing adenovirus vector was transfected into the SGC-7901/DDP cells to upregulate Fas expression. The cell viability was detected by CCK-8 assay. The cell cycle and cell apoptosis were analyzed by flow cytometry. The protein levels of Fas, P38/p-P38, JNK/p-JNK, cleaved caspase-8/caspase-8 and cleaved caspase-3/caspase-3 were detected by Western blot.RESULTS: The expression of Fas at both mRNA and protein levels was significantly downregulated in the SGC-7901/DDP cells. Fas expression was decreased by cisplatin in a dose-dependent manner in the SGC-7901 cells. Overexpression of Fas suppressed the viability and induced apoptosis in the SGC-7901/DDP cells, and upregulated the protein levels of p-P38, p-JNK, cleaved caspase-8 and cleaved caspase-3.CONCLUSION: Overexpression of Fas increases the sensitivity of the SGC-7901/DDP cells to cisplatin, and inhibits the cell growth and promotes cell apoptosis. The mechanism may be related to the activation of JNK and P38 pathway.

Fas; Stomach cancer; Cisplatin resistance; Cell apoptosis

雜志網址： http://www.cjpp.net

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△通訊作者 Tel: 0573-82824033; E-mail: hg15868181011@163.com

R735.2

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