雷公藤甲素通過ERK通路誘導肺癌A549細胞自噬*

王 偉， 王 坤

(杭州市下沙醫(yī)院 1藥學部， 2神經外科，浙江 杭州 310018)

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雷公藤甲素通過ERK通路誘導肺癌A549細胞自噬*

王 偉1， 王 坤2△

(杭州市下沙醫(yī)院1藥學部，2神經外科，浙江 杭州 310018)

目的： 研究雷公藤甲素(tripchlorolide，TP)對肺癌A549細胞活力及自噬的影響，并初步探討其作用機制。方法: 應用TP作用于肺癌A549細胞后，MTT法檢測細胞活力；吖啶橙染色(AO)法在熒光顯微鏡下觀察細胞自噬狀態(tài)；GFP-LC3質粒轉染實驗觀察細胞胞質中綠色點狀聚集的自噬小體； Western blot法檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ的表達情況及有關的信號通路ERK蛋白水平的變化。結果: TP可以顯著抑制肺癌A549細胞的增殖(P<0.05)，并呈一定的劑量-時間依賴關系。TP作用于肺癌A549細胞48 h后，細胞內酸性濾泡染成亮紅色熒光比例增多。GFP-LC3轉染實驗結果顯示在100 nmol/L TP處理后，細胞胞質中出現綠色點狀聚集的自噬小體，而正常培養(yǎng)組極少細胞有自噬小體形成；同時轉染GFP-control質粒的細胞在100 nmol/L TP處理及正常培養(yǎng)條件下均未觀察到點狀聚集的自噬小體產生。TP作用于肺癌A549細胞48 h后，與對照組相比，100 nmol/L TP組LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，同時p-ERK/ERK蛋白水平也顯著升高(P<0.01)；與100 nmol/L TP組相比，TP+3-MA組LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著下降(P<0.01)，同時p-ERK/ERK蛋白水平也顯著下降(P<0.01)。結論: TP可顯著抑制肺癌A549細胞活力并誘導細胞發(fā)生自噬，這種作用可能與影響ERK的磷酸化有關。

肺癌; 雷公藤甲素; 細胞增殖; 自噬

雷公藤甲素(tripchlorolide，TP)是從雷公藤中提取到的主要活性物質，眾多研究表明其是一種廣譜腫瘤抑制劑，對乳腺癌、T細胞淋巴瘤、肝細胞癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌等多種腫瘤具有抑制作用[1-2]。肺癌已經成為我國發(fā)病率最高的癌癥之一，手術及放、化療是目前主要的治療手段，但是肺癌手術切除后易復發(fā)，嚴重影響遠期療效，此外肺癌對目前常用的化療藥物不敏感，化療效果不能令人滿意。自噬在腫瘤進展中的角色隨疾病病程而不斷發(fā)生動態(tài)變化，隨著研究的不斷深入，越來越多的資料顯示自噬性細胞死亡在許多腫瘤包括肺癌的發(fā)生發(fā)展中占有重要地位[3]。本研究根據已有研究結論，結合當前抗腫瘤研究的熱點，觀察雷公藤甲素對肺腺癌細胞A549活力的影響，并進一步研究雷公藤甲素誘導肺癌細胞的自噬現象，及其可能的作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料

TP、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、雷帕霉素(rapamycin，Rapa)和吖啶橙(acridine orange，AO)購自Sigma；非小細胞肺癌A549細胞購自中國科學院上海細胞所；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于碧云天生物公司；β-actin、LC3、細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)及p-ERK抗體購自美國CST。iMARK型全自動酶標儀、垂直電泳儀、水平電泳儀購自Bio-Rad；倒置熒光顯微鏡(Leica)。

2 主要方法

2.1 細胞培養(yǎng) A549細胞于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中。細胞貼壁生長良好，每3 d傳代1次。取對數生長期的細胞進行實驗。

2.2 MTT檢測細胞活力 取對數生長期細胞以5.0×107/L的濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，加入不同濃度TP(25、50、100、150、200 nmol/L)，以不加TP處理組為對照組，加入不同濃度藥物的為實驗組。分別于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加入20 μL MTT(2 g/L)，繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150 μL，在酶標儀490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值。每個濃度設6個復孔，重復實驗3次。

2.3 吖啶橙染色 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，將細胞接種于24孔板，37 ℃、5% CO2孵育培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的TP及Rapa，各組藥物作用于肺癌A549細胞48 h后，吸盡舊培養(yǎng)液，用PBS緩沖液清洗3遍，加入終濃度為1 mg/L的吖啶橙溶液，避光染色15 min，棄去吖啶橙溶液，用PBS緩沖液清洗3遍，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，實驗重復3次。

2.4 GFP-LC3轉染實驗 將肺癌A549細胞按每孔5×105個細胞接種于6孔板中，待細胞融合至80%左右時使用Lipofectamine 2000轉染重組質粒GFP-LC3及對照質粒GFP-control。在離心管中加入100 μL Opti-MEM和4 μg質粒GFP-LC3混勻制成DNA稀釋液。在另一個離心管中加入100 μL Opti-MEM和4 μL Lipofectamine 2000混勻制成Lipo稀釋液，室溫靜置5 min。將DNA稀釋液和Lipo稀釋液混勻，室溫靜置20 min，將其加入到細胞中，使之均勻分散。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.5 Western blot法檢測相關蛋白表達 細胞經RIPA裂解液裂解30 min，冰上進行操作。收集到EP管，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度定量，95～100 ℃煮沸5 min，即為樣本蛋白。每個泳道加入蛋白樣品10 μg，經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，利用濕法將蛋白轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入對應 I 抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次后，加入對應 II 抗室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，定影后進行分析。

3 統計學處理

所有實驗均重復3次，實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應用Bonferroni檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 雷公藤甲素對肺癌A549細胞活力的影響

MTT實驗結果顯示，隨著給藥劑量和時間的增加，TP對肺癌細胞的生長抑制率顯著上升，且呈一定的劑量-時間依賴關系，在給藥24 h后，TP的IC50為190.81 nmol/L；在給藥48 h后，TP的IC50為150.32 nmol/L；在給藥72 h后，TP的IC50為73.86 nmol/L。結果表明，TP作用肺癌A549細胞后其細胞活力被顯著抑制，見圖1。

Figure 1.The effect of TP on the cell viability in different groups after 24 h, 48 h and 72 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vs0 nmol/L.

圖1 不同濃度的雷公藤甲素對肺癌 A549 細胞活力的影響

2 吖啶橙染色觀察雷公藤甲素作用肺癌A549細胞后自噬泡的變化

吖啶橙可將胞質內酸性自噬泡染成紅色，與對照組相比， Rapa陽性對照組胞質內酸性自噬泡染成紅色明顯，提示自噬水平增加。與對照組相比，TP作用于肺癌A549細胞48 h后細胞內酸性濾泡染成亮紅色熒光比例增多，其中以100 nmol/L TP最為明顯，見圖2。因此，后續(xù)實驗選擇100 nmol/L作為實驗濃度。

3 轉染GFP-LC3觀察雷公藤甲素作用肺癌A549細胞后綠色熒光斑點的變化

由上述吖啶橙染色和Western blot法檢測結果可知，100 nmol/L TP誘導肺癌A549細胞自噬現象較為明顯。為進一步驗證TP確實能誘導肺癌A549細胞自噬現象，我們選擇GFP-LC3轉染實驗于肺癌A549細胞中進行驗證。 GFP-LC3轉染實驗結果顯示，轉染GFP-LC3質粒的細胞在100 nmol/L TP處理后，細胞胞質中出現綠色點狀聚集的自噬小體，而正常培養(yǎng)組極少細胞有自噬小體形成。轉染GFP-control對照質粒的細胞在100 nmol/L TP處理及正常培養(yǎng)條件下均未觀察到點狀聚集的自噬小體產生。這說明100 nmol/L TP能誘導肺癌A549細胞發(fā)生自噬，見圖3。

Figure 2.The change of autophagy vesicles in A549 cells after treated with TP (×400).

圖2 不同濃度的雷公藤甲素對肺癌 A549 細胞自噬的影響

Figure 3.The change of autophagosome in A549 cells after treated with TP(×400).

圖3 熒光顯微鏡觀察轉染GFP-LC3質粒肺癌A549細胞中自噬小體的形成

4 雷公藤甲素對肺癌A549細胞LC3蛋白表達的變化

Western blot法檢測結果如圖4所示，藥物作用于肺癌A549細胞48 h后，與空白對照組相比，100 nmol/L TP組的LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；與TP組相比，TP+3-MA組的LC3-Ⅱ蛋白表達水平顯著下降(P<0.01)，說明3-MA減弱了TP誘導肺癌A549細胞的自噬水平。

5 雷公藤甲素對肺癌A549細胞ERK磷酸化的影響

Western blot法檢測結果顯示，藥物作用肺癌A549細胞48 h后，與對照組相比，TP組p-ERK/ERK的蛋白水平顯著升高(P<0.01)，但低于自噬誘導劑Rapa組；與TP組相比，TP+3-MA組的p-ERK/ERK蛋白水平顯著下降(P<0.01)，見圖5。

Figure 4.The protein levels of LC3-I and LC3-Ⅱin the lung cancer A549 cells treated with TP. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsTP.

圖4 雷公藤甲素對肺癌A549細胞LC3蛋白表達的變化

Figure 5.The protein levels of ERK and p-ERK in the lung cancer A549 cells treated with TP. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsTP.

圖5 雷公藤甲素對肺癌A549細胞p-ERK/ERK蛋白水平的影響

討 論

肺癌是當今全球危害性最大的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在世界范圍內呈持續(xù)上升趨勢。我國的肺癌居惡性腫瘤死亡的第一位。化療目前是肺癌最有效的治療方法之一， 然而傳統的肺癌化療藥物常因其各種嚴重的副作用使得其臨床應用受到很大限制，因此尋找毒性更低、副作用更小的治療肺癌化療藥物已成為醫(yī)藥界的一個重要課題。雷公藤甲素是從雷公藤中提取到的主要活性物質，系一種環(huán)氧二萜單體成分。近年來的研究發(fā)現，雷公藤甲素具有很好的抗排異、抗腫瘤及抗生育作用[4-5]。自噬作為Ⅱ型程序性死亡已經越來越受到人們的重視，在自噬發(fā)生的早期，自噬可作為一種保護機制，使腫瘤細胞避免受到低營養(yǎng)電離輻射和化療等所致的損傷而持續(xù)生存；而當外部環(huán)境較差，腫瘤細胞過度自我吞噬時，就會引起自噬性死亡，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究還表明不同細胞自噬能力不同，但是在癌變之后其自噬能力有所減弱即在一些藥物作用下自噬可以在腫瘤細胞中被激活，表明自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療過程中有一定的作用。LC3是酵母自噬基因Apg8/Aut7p的哺乳動物同源物，目前認為細胞中LC3Ⅱ的含量和細胞內自噬泡的數量呈正相關，可以反映細胞的自噬現象和細胞內自噬泡的多少，是研究自噬現象的標志分子[6]。然而，在腫瘤中雷公藤甲素對自噬的研究又較少，如Mujumdar 等[7]研究認為雷公藤甲素能誘導胰腺癌細胞自噬，Krosch等[8]研究認為雷公藤甲素在神經母細胞瘤細胞中通過凋亡和自噬途徑引起細胞死亡。本實驗希望通過研究雷公藤甲素對人肺癌細胞自噬的影響及其可能的作用機制，為肺癌及其它腫瘤化療提供一個新的選擇。我們的實驗結果顯示，雷公藤甲素顯著抑制肺癌細胞的生長，并呈一定的劑量-時間依賴性。雷公藤甲素作用肺癌A549細胞48 h后，細胞內酸性濾泡染成亮紅色熒光明顯增多，轉染GFP-LC3質粒的細胞胞質中出現綠色點狀聚集的自噬小體，LC3-Ⅱ蛋白表達水平也顯著升高。表明雷公藤甲素能誘導肺癌A549細胞發(fā)生自噬性死亡，從而抑制細胞活力。

ERK是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是MAPK家族的一員，包括ERK1和ERK2。磷酸化激活的ERK1/2由胞質轉位到核內，進而介導Elk-1、ATF、NF-κB、AP-1、c-Fos和c-Jun的轉錄活化，參與細胞的增殖與分化、細胞形態(tài)維持、細胞骨架的構建、細胞凋亡和細胞的癌變等多種生物學反應[9-10]。Yue等[11]研究發(fā)現抑制GRIM-19的表達可通過激活p-ERK誘導人宮頸癌細胞發(fā)生自噬。Huang 等[12]研究也發(fā)現在肝癌細胞中Apelin-13能通過激活ERK1/2誘導自噬。雷公藤甲素在肺癌細胞中通過激活p-ERK誘導自噬未見報道。本研究發(fā)現雷公藤甲素抑制A549的細胞活力并誘導其發(fā)生自噬的同時還能夠明顯增加p-ERK的蛋白水平。說明雷公藤甲素可能通過影響ERK蛋白磷酸化從而抑制細胞生長，促進自噬體的形成。

綜上所述，本實驗初步研究表明雷公藤甲素作為一種天然存在的化合物能夠抑制肺癌A549細胞的活力并誘導其自噬，可為雷公藤甲素應用于肺癌的臨床治療提供實驗依據。目前關于雷公藤甲素是如何通過ERK調節(jié)肺癌細胞自噬的研究文獻較少，本研究推測MAPK信號通路可能參與雷公藤甲素誘導的自噬，具體的機制有待于進一步研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Tripchlorolide activates p-ERK and induces autophagy in lung cancer A549 cells

WANG Wei1, WANG Kun2

(1DepartmentofPharmacy,2DepartmentofNeurosurgery,HangzhouXiashaHospital,Hangzhou310018,China.E-mail:simonkunwang@hotmail.com)

AIM: To investigate the effects of tripchlorolide (TP) on proliferation and autophagy of human lung cancer A549 cells, and explore its mechanism. METHODS: MTT assay was performed to analyze the effect of TP on the viability of human lung cancer A549 cells. The A549 cells were treated with TP, and their autophagy was observed under the fluorescence microscope through acridine orange staining. Green fluorescence spots were observed by fluorescence microscopy through GFP-LC3 plasmid transfection experiment. The levels of LC3 and p-ERK in the A549 cells after TP treatment were determined by Western blot. RESULTS: The viability of human lung cancer A549 cells was significantly inhibited by TP in a dose-time dependent manner (P<0.05). The number of the intracellular acidic follicles dyed with bright red fluorescence was significantly increased after TP treatment in A549 cells. The number of green dot-like congregate autophagosomes in cell cytoplasm was significantly increased after TP treatment in the A549 cells transfected with GFP-LC3 plasmid, while the normal treatment only induced a few cells with autophagosome formation. At the same time, we did not observe the dot-like congregate autophagosomes after TP treatment in the A549 cells transfected with GFP-control plasmid. Compared with control group, the expression of LC3-II protein was up-regulated in A549 cells after TP treatment (P<0.01). Furthermore, treatment with TP in A549 cells for 48 h also led to a significant upregulation of phosphorylated form of ERK (P<0.01). In contrast, no significant change in the levels of total ERK protein was observed. Compared with 100 nmol/L TP group, TP+3-MA group down-regulated the protein levels of LC3-II (P<0.01) and p-ERK (P<0.01) in the A549 cells. CONCLUSION: TP significantly inhibits the growth of A549 lung cancer cells and induces the autophagy, which may be correlated with upregulation of p-ERK protein.

Lung cancer; Tripchlorolide; Cell proliferation; Autophagy

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2016- 04- 05

2016- 05- 23

國家自然科學基金資助項目(No. 81402044); 浙江省自然科學基金資助項目(No. LY14H160017)

△ 通訊作者 Tel: 0571-86006166; E-mail: simonkunwang@hotmail.com

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.003