Box-Behnken響應面法優化通關藤總皂苷的超聲提取工藝及其純化工藝研究Δ

徐東偉，王紹輝，劉同祥#（1.中央民族大學醫院藥劑科，北京 100081；.中央民族大學中國少數民族傳統醫學研究院，北京 100081）

Box-Behnken響應面法優化通關藤總皂苷的超聲提取工藝及其純化工藝研究Δ

徐東偉1＊，王紹輝2，劉同祥2#（1.中央民族大學醫院藥劑科，北京 100081；2.中央民族大學中國少數民族傳統醫學研究院，北京 100081）

目的：優化通關藤中總皂苷的超聲提取工藝及純化工藝，制備純化的通關藤總皂苷。方法：以通關藤總皂苷提取率為指標，以乙醇體積分數、液料比和提取溫度等為因素，采用單因素試驗和Box-Behnken響應面法優化通關藤總皂苷的超聲提取工藝；以洗脫液中總皂苷含量為指標，考察乙醇洗脫體積分數對總皂苷經D101型大孔吸附樹脂吸附純化工藝的影響。結果：最優超聲提取工藝條件為乙醇體積分數85%、液料比18.5∶1（ml/g）、提取溫度80 ℃；驗證試驗中通關藤總皂苷平均提取率為4.80% （RSD=1.06%，n=3），與預測值4.89%接近，偏差為1.84%。最優純化工藝條件為以45%乙醇為洗脫溶劑除雜，再用90%乙醇進行純化；驗證試驗表明通關藤總皂苷含量實測平均值為62.45%（RSD=0.88%，n=3）。結論：優化后的工藝可較好地提取、純化通關藤中的總皂苷，且工藝穩定、可靠。

通關藤；總皂苷；提取工藝；Box-behnken響應面法；大孔吸附樹脂；純化

通關藤為蘿摩科植物通關藤［Marsdenia tenacissima（Roxb.）Wight etArn.］的干燥藤莖［1］，亦稱烏骨藤、通光藤、奶漿藤等，主要分布于云南、貴州、廣西和四川等地［2］。通關藤始載于《滇南本草》［3］，為我國傳統民族藥材，其味苦，性甘、涼，入肺、胃、膀胱經；具有清熱解毒、止咳平喘、調節免疫作用，在云南、貴州民間廣泛用于治療癌癥。現代藥理研究表明，通關藤含有的獨特化學成分，具有明顯的抗腫瘤、免疫調節、保肝利尿、敗毒抗癌等作用，對胃癌、肝癌、肺癌等療效確切，以其為主要原料制備而成的消癌平制劑，在臨床上用于治療各種惡性腫瘤，療效良好［4-6］。通關藤含有甾體苷、多糖、生物堿、有機酸、樹脂及色素等多種化學成分，其中C21甾體苷類是其主要的化學成分。迄今為止，從中分離鑒定的C21甾體苷類化合物已達到50多種［7］。皂苷類成分被認為是具有抗腫瘤作用的主要活性物質。目前國內外對通關藤總皂苷的提取、純化工藝鮮有文獻報道，筆者采用響應面法對通關藤總皂苷的提取工藝進行優化，并考察大孔吸附樹脂純化通關藤總皂苷的工藝條件，優化其提取、純化的工藝流程，為通關藤總皂苷的開發利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-4802H型紫外-可見分光光度計（美國Unic公司）；JMB10001型電子分析天平（余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司）；AL404型萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；101-1AB型電熱恒溫鼓風干燥箱、DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；Heidolph 4000型旋轉蒸發器（德國Heidolph公司）。

1.2 樹脂、藥材、對照品與試劑

D-101型大孔吸附樹脂（天津海光化工有限公司，非極性，批號：110512）；通關藤藥材（廣州市華宇藥業有限公司，批號：201310，經中央民族大學劉同祥教授鑒定為真品）；對照藥材通關藤（批號：121522-201202）、通關藤苷H對照品（批號：111913-201202，純度：99.8%）均來源于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、香草醛、濃硫酸、冰醋酸等化學試劑均為分析純，購自北京化工廠。

2 方法與結果

2.1 通關藤總皂苷含量測定（香草醛-高氯酸法）[8]

2.1.1 最大波長的確定 準確稱取干燥至恒質量的通關藤苷H對照品2.0 mg，加甲醇超聲溶解，定容至10 ml量瓶中，搖勻，即為對照品溶液。精密吸取對照品溶液0.5 ml置于試管中，水浴加熱揮干除去溶劑，加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.4 ml、高氯酸0.6 ml，搖勻；待溶液呈玫瑰紅色后，在70 ℃水浴中加熱15 min，冰水浴5 min冷卻；加冰乙酸10 ml，搖勻，放置20 min，在400～600 nm波長下掃描，確定最大吸收波長。結果通關藤苷H在可見光區域內最大吸收波長為462 nm。

2.1.2 標準曲線的繪制 分別精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 ml，置于試管中，自“2.1.1”項下“水浴加熱揮干除去溶劑”起操作，在462 nm波長處測定吸光度（A），以甲醇作為空白對照。以通關藤苷H質量濃度（c）為橫坐標、A為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為A=31.01c+0.003（R2=0.998）。結果表明，通關藤苷H檢測質量濃度線性范圍為1.83～29.18μg/ml。

2.1.3 精密度、重復性和穩定性試驗 按相關方法操作，結果精密度試驗中吸光度的RSD=1.24%（n=6），重復性試驗中樣品含量的RSD=1.52%（n=6），穩定性試驗中樣品含量的RSD=1.72%（n=6，120 min內）。

2.1.4 加樣回收率試驗 準確稱取已知總皂苷含量（4.05%）的通關藤粉末6份，分別加入通關藤苷H對照品約1 mg，80%乙醇超聲提取20 min。按“2.1.2”項下方法操作后測定各供試品溶液的吸光度，代入回歸方程，計算樣品中總皂苷含量及回收率。結果平均回收率為98.85%（RSD=1.57%，n=6）。

2.1.5 總皂苷含量測定 準確稱取通關藤總皂苷樣品100 mg置于20 ml量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度。準確吸取0.2 ml置于試管中，按“2.1.2”項下方法操作后測定吸光度，代入回歸方程，根據樣品質量濃度計算樣品中總皂苷含量。

2.2 單因素試驗

在預試驗的基礎上選擇超聲提取中的乙醇體積分數、液料比、提取溫度、提取時間為試驗因素，通過考察各因素對通關藤總皂苷提取率的影響，確定相關因素及其范圍。試驗中超聲功率為500 W、超聲頻率為40 kHz。總皂苷提取率計算公式為：樣品中通關藤皂苷的質量/通關藤藥材質量×100%。

2.2.1 乙醇體積分數對提取率的影響 精確稱取通關藤粉末5 g共5份，分別置于250 ml錐形瓶中，提取溫度為40 ℃，液料比為15∶1，分別在50%、60%、70%、80%、90%乙醇條件下超聲提取25 min。過濾，將濾液蒸干，干燥得通關藤粗皂苷，按“2.1.5”項下方法操作并測定，考察乙醇體積分數對通關藤總皂苷提取率的影響。每次試驗重復3次。結果，以80%乙醇為提取溶劑時通關藤總皂苷提取率最優，詳見圖1A。

圖1 各因素對通關藤總皂苷提取率的影響Fig 1 Effects of each factor on the yield of total saponins

2.2.2 液料比對提取率的影響 準確稱取通關藤粉末5 g共5份，分別置于250 ml錐形瓶中，提取溶劑為80%乙醇溶劑，提取溫度為40 ℃，分別在液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1條件下超聲提取25 min。過濾，將濾液蒸干，干燥得通關藤粗皂苷，按“2.1.5”項下方法操作并測定。每次試驗重復3次。結果，以液料比為15∶1時通關藤總皂苷提取率最優，詳見圖1B。

2.2.3 提取溫度對提取率的影響 準確稱取通關藤粉末5 g 共5份，分別置于250 ml錐形瓶中，提取溶劑為80%乙醇溶劑，液料比為15∶1，分別在30、50、60、70、80 ℃ 條件下超聲提取25 min。過濾，將濾液蒸干，干燥得通關藤粗皂苷，按“2.1.5”項下方法操作并測定。每次試驗重復3次。結果，提取溫度為70 ℃ 時通關藤總皂苷提取率最高，詳見圖1C。

2.2.4 提取時間對提取率的影響 精確稱取通關藤粉末5 g 共5份，分別置于250 ml錐形瓶中，提取溶劑為80%乙醇溶劑，提取溫度為40 ℃，液料比為15∶1，分別超聲提取25、50、75、100、125 min。過濾，濾液蒸干，干燥得通關藤粗皂苷，按“2.1.5”項下方法操作并測定。每次試驗重復3次。結果，提取時間與通關藤總皂苷提取率關系不明顯，詳見圖1D，故在響應面試驗中剔除該因素。

2.3 響應面試驗

2.3.1 試驗設計 準確稱取通關藤藥材17份，每份5 g，參考文獻［9-10］中方法，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，在單因素試驗基礎上，以乙醇體積分數（A）、液料比（B）和提取溫度（C）3個因素為自變量，每個自變量的低、中、高水平分別以－1、0、1進行編碼，以通關藤總皂苷提取率（Y）為響應值。應用Design-Expert 8.0.6軟件設計3因素3水平（共17個試驗點、5個中心點）的響應面試驗，利用響應面試驗結果，確定通關藤總皂苷的最優提取條件。試驗因素與水平見表1，試驗設計與結果見表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 Box-Behnken中心組合試驗設計與結果Tab 2 Design and results of Box-Behnken central composite design

2.3.2 多元二次回歸模型的建立 采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中數據進行多項式擬合回歸。結果發現，其中BC、AC、C2項的P值均＞0.05，為不顯著項，故將其剔除，手動優化。最終建立多元二次響應面回歸模型為Y=4.46+0.28A+0.56B+0.18C+0.29AB－0.5A2－0.53B2（R2=0.949 3）。由R2值表明該方程擬合性良好，可以用該方程代替真實試驗進行分析。各因素的方差分析結果見表3。

表3 回歸模型的方差分析結果Tab 3 Results of variance analysis of regression model

采用Design-Expert 8.0.6軟件的ANOVA分析響應面的回歸參數，回歸方程中各自變量對響應值的顯著性由F檢驗來判定。模型項P＜0.01，說明Y與A、B、C回歸方程的關系是顯著的；失擬項P＞0.05，說明方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小，可以通過該模型預測試驗結果。各因素對通關藤總皂苷提取率的影響由大到小依次為液料比（B）、乙醇體積分數（A）、提取溫度（C）。

2.3.3 效應面分析 由“2.3.2”項分析可知，交互項只有AB項具有顯著性。通過Design-Expert 8.0.6軟件分析可以得出A、B因素交互影響超聲提取總皂苷的響應曲面和等高線圖，直觀地反映AB因素交互作用對響應值的影響，結果見圖2。

圖2 乙醇體積分數與液料比對總皂苷提取率影響的響應面和等高線圖Fig 2 Response surface and contour plots for the effects of ethanol volume fraction and solvent-solid ratio on the extraction rate of total saponins

由圖2可知，當提取溫度一定時，總皂苷提取率隨乙醇體積分數和液料比的升高均呈先上升后下降的趨勢，在乙醇體積分數約為85%、液料比約為18∶1時，達到最大值。

2.3.4 提取工藝驗證試驗 通過回歸模型預測的通關藤總皂苷提取的最優工藝條件為乙醇體積分數84.82%、液料比18.31∶1、提取溫度80 ℃；通關藤總皂苷提取率理論值為4.89%。實際試驗中對上述工藝參數修正為乙醇體積分數85%、液料比18.5∶1、提取溫度為80 ℃ 進行驗證試驗。

準確稱取通關藤粉末3份，每份100 g，置于3 000 ml燒杯中，按照上述修正的最優工藝進行3組平行試驗，驗證通關藤總皂苷的提取工藝。結果測得通關藤總皂苷提取率平均值為4.80%（RSD=1.06%，n=3），與預測值相比偏差為1.84%，二者比較接近，說明采用響應面法得到的工藝參數準確、可靠。

2.4 純化工藝的優選

2.4.1 大孔吸附樹脂預處理 根據預試驗結果選擇D101大孔吸附樹脂。稱取D101大孔吸附樹脂30 g（干質量），95%乙醇浸泡24 h，濕法裝柱（26 cm×2.8 cm），用95%乙醇洗至流出液與水（1∶3）混合無白色混濁現象，再用蒸餾水反復洗脫至洗脫液無明顯乙醇氣味并且樹脂柱不再下降時即可。

2.4.2 洗脫溶劑的選擇 準確稱取100 g通關藤藥材，按最優提取工藝提取3次；合并提取液并濃縮到一定量，加至預先處理好的D101柱預吸附1 h，用蒸餾水洗至流出液不顯Molish反應，棄去水洗脫液；然后依次用30%、45%、60%、75%、90%、95%的乙醇梯度洗脫，控制流速為1倍柱體積（BV）/h左右，每個體積分數的乙醇洗脫5 BV。每1 BV收集1次洗脫液，共收集30份。將每份樣品液制成干浸膏稱量，并測定通關藤總皂苷的含量，繪制洗脫曲線，考察不同體積分數乙醇的洗脫效果，結果見表4和圖3（圖中乙醇體積分數：1～5號為30%，6～10號為45%，11～15號為60%，16～20號為75%，21～25號為90%，26～30號為95%）。

表4 不同體積分數乙醇的洗脫效率Tab 4 Elution effects of different volume fraction of ethanol

圖3 梯度洗脫曲線Fig 3 Gradient elution curve

從表4和圖3可以看出，通關藤總皂苷主要集中在60%、75%和90%乙醇洗脫液中，占全部洗脫液中通關藤總皂苷的80%以上。為了得到含量較高的通關藤總皂苷，可以選擇用45%乙醇洗去雜質，然后再用90%乙醇洗脫進行純化。

2.4.3 精制皂苷的含量測定 精確稱取100 g通關藤藥材3份，按“2.4.2”項下方法提取操作后上D101柱，用5 BV的45%乙醇洗脫后，用90%乙醇洗脫5 BV。收集90%乙醇洗脫液，回收溶劑，蒸干可得純化的通關藤總皂苷。經測定，純化后的皂苷含量平均值為62.45%（RSD=0.88%，n=3），說明純化工藝可制得純度較高的通關藤總皂苷，且工藝操作簡單、重現性良好。

綜上所述，本研究得出通關藤總皂苷的最優超聲提取工藝：提取溶劑為85%乙醇，液料比為18.5∶1，提取溫度為80 ℃ 。最優純化工藝：提取液濃縮后上D101柱，用45%乙醇洗脫除雜后，再用90%乙醇洗脫進行純化。在此條件下可制得含量較高的通關藤總皂苷，且方法簡單易行，可擴大生產。

3 討論

本研究通過單因素試驗和響應面分析，確定了超聲提取通關藤總皂苷3個因素的主次關系并得到了提取效果最優的理論工藝條件。通過驗證試驗表明通關藤總皂苷提取率實測值與理論值基本吻合，提取率較高，說明采用響應面法得到的工藝參數是準確可靠的。

預試驗中通過比較不同種類大孔吸附樹脂，發現D101型大孔吸附樹脂吸附快、吸附量大、洗脫率高、洗脫速度較快、洗脫時間短，對通關藤總皂苷有較好的富集純化效果，且價格便宜，適合規模化生產。

使用D101型大孔吸附樹脂以45%乙醇洗去雜質，再用90%乙醇純化可得到含量較高的通關藤總皂苷。目前以通關藤原料制備而成的中藥制劑有消癌平片、消癌平糖漿、消癌平膠囊和消癌平注射液，臨床廣泛用于治療肝癌、胃癌、肺癌等各種晚期惡性腫瘤［11-13］，然而這些制劑多為通關藤藥材的水提物。在本試驗進行過程中，筆者發現通關藤藥材的主要活性物質皂苷類極性較小、水溶性較差，水提物中的皂苷含量很低；而以本試驗方法得到的皂苷含量較高。后期可通過臨床前研究對其藥理活性進行進一步深入探索，研究其作為原料藥用于抗腫瘤藥物開發的可能性。下一步擬以消癌平口服液為陽性對照，研究通關藤總皂苷對Lewis肺癌裸鼠的腫瘤抑制作用，為開發研究以通關藤總皂苷為原料藥的抗癌新藥提供科學依據。

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Optimization of Ultrasonic Extraction of Total Saponins from Marsdenia tenacissima by Box-Behnken Response Surface Method and Its Purification Technology

XU Dongwei1，WANG Shaohui2，LIU Tongxiang2（1.Dept.of Pharmacy，Hospital of Minzu University of China，Beijing 100081，China；2.Institute of Chinese Minority Traditional Medicine，Minzu University of China，Beijing 100081，China）

OBJECTIVE：To optimize the ultrasonic extraction and purification technology of total saponins from Marsdenia tenacissima，and to prepare purified total saponins from M.tenacissima.METHODS：Using the extraction rate of total saponins from M.tenacissima as index，ethanol volume fraction，solvent-solid ratio and extraction temperature as factors，ultrasonic extraction technology of total saponins from M.tenacissima was optimized by single factor test and Box-Behnken response surface design.Using the content of total saponins in elution，the effects of ethanol elution volume fraction on purification technology of total saponins by D101 type macroporous adsorption resin was investigated.RESULTS：The optimal ultrasonic extraction technology was as follows as ethanol volume fraction of 85%，solvent-solid ratio of 18.5∶1（ml/g），extraction temperature of 80 ℃.In verification test，the average extraction rate of total saponins from M.tenacissima was 4.80%（RSD=1.06%，n=3）；it was close to predicted value 4.89%，and the deviation was 1.84%.The optimal purification technology was as follows as 45%ethanol as eluant，90% ethanol for purification.Verification test showed that the average content of total saponins from M.tenacissima was 62.45%（RSD= 0.88%，n=3）.CONCLUSIONS：The optimized technology can be used for the extraction and purification of total saponins from M.tenacissima.The technology is stable and reliable.

Marsdenia tenacissima；Total saponins；Extraction technology；Box-Behnken response surface method；Macroporous adsorption resin；Purification

R285.2

A

1001-0408（2016）25-3535-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.24

2016-02-16

2016-03-27）（編輯：劉 萍）

國家自然科學基金面上項目（No.81073151）

＊主管藥師，博士研究生。研究方向：醫院藥學、天然藥物研發。電話：010-68932277。E-mail：xudongwei@muc.edu.cn

研究員，博士生導師，博士。研究方向：民族醫藥研發。電話：010-68933254。E-mail：binghe6665_cn@sina.com