前列地爾對缺氧損傷的人肺微血管內(nèi)皮細胞中VEGF和eNOS表達的影響

王友俊，張玲美（萊蕪鋼鐵集團有限公司醫(yī)院傳染科，山東萊蕪 271126）

前列地爾對缺氧損傷的人肺微血管內(nèi)皮細胞中VEGF和eNOS表達的影響

王友俊＊，張玲美（萊蕪鋼鐵集團有限公司醫(yī)院傳染科，山東萊蕪 271126）

目的：研究前列地爾對缺氧損傷的人肺微血管內(nèi)皮細胞（HPMECs）中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）表達的影響。方法：將HPMECs分為A組（正常培養(yǎng)）、B組（3%O2培養(yǎng)）、C組（3%O2培養(yǎng)+15 μg/L前列地爾）及D組（3%O2培養(yǎng)+45 μg/L前列地爾），相應培養(yǎng)24 h。觀察各組細胞形態(tài)，MTT比色法檢測細胞活力（以吸光度計），流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Western blot法檢測細胞中VEGF、eNOS相對表達量。結果：A、D組細胞密度較高，B、C組細胞密度較低。與A組比較，B、C、D組細胞活力降低、凋亡率升高、VEGF與eNOS表達增強、eNOS/VEGF減少（P＜0.05）。與B組比較，C、D組細胞活力增加、VEGF表達減弱（P＜0.05）；D組細胞凋亡率降低、eNOS表達減弱、eNOS/VEGF增加（P＜0.05）。與C組比較，D組細胞凋亡率降低、VEGF表達減弱、eNOS/VEGF增加（P＜0.05）。結論：前列地爾可能通過上調(diào)HPMECs的eNOS/VEGF發(fā)揮保護作用。

前列地爾；缺氧損傷；人肺微血管內(nèi)皮細胞；血管內(nèi)皮生長因子；內(nèi)皮型一氧化氮合成酶

缺氧可以導致肺血管內(nèi)皮功能障礙，引起肺血管強烈收縮及血管平滑肌細胞大量增生，促進缺氧性肺動脈高壓的發(fā)生［1］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）可以誘導血管內(nèi)皮細胞增殖、血管內(nèi)皮增厚、動脈血壓升高；內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）具有較強的心血管保護作用，可以抑制血管內(nèi)皮細胞增生及血管平滑肌遷移，防止肺動脈高壓進展［2-3］。既往研究發(fā)現(xiàn)，前列地爾的擴血管作用能降低慢性阻塞性肺病并肺動脈高壓患者的肺動脈壓力，但其機制尚未明確［4］。為此，本文從VEGF和eNOS角度研究前列地爾對缺氧損傷的人肺微血管內(nèi)皮細胞（HPMECs）的影響機制。

1 材料

1.1 儀器

CX41奧林巴斯顯微鏡（上海西努光學科技有限公司）；FC500 MCL/MPL流式細胞儀、Gallios流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；3-18R高速冷凍離心機（湖南恒諾儀器設備有限公司，離心半徑：6 cm）；DG5033A酶標儀（南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司）；Image-Pro Insight圖像分析軟件（廣州市明美光電技術有限公司）。

1.2 藥品與試劑

前列地爾原料藥（大連美侖生物技術有限公司，批號：20140207，純度：95.00%）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號：20140301）；胰蛋白酶（杭州沃森生物技術有限公司，批號：20140412）；Cellmax澳洲胎牛血清［賽澳美細胞技術（北京）有限公司，批號：20140811］；MTT（上海源葉生物科技有限公司，批號：20140207，純度：98.00%）；二甲基亞砜（DMSO，重慶市華雅干細胞技術有限公司，批號：20140315）；AnnexinⅤ-異硫氰酸熒光素（FIFC）細胞凋亡檢測試劑盒（上海睿時生物科技有限公司，批號：20131204）；小鼠抗人VEGF抗體（武漢艾美捷科技有限公司，批號：20140105）；小鼠抗人eNOS抗體（上海一研生物科技有限公司，批號：20140597）；小鼠抗人β-actin抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠多克隆抗體（北京中杉金橋公司，批號：20140307、20140102）。

1.3 細胞

HPMECs購自上海素爾生物科技有限公司。

2 方法

2.1 HPMECs細胞培養(yǎng)

將HPMECs及2 ml含10%胎牛血清的100 u/ml青霉素-0.1 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1～2 d換液1次，直至細胞融合90%時進行傳代，取3～5代細胞用于試驗。

2.2 缺氧損傷模型建立與分組

將HPMECs置于無血清培養(yǎng)基中處理12 h使細胞同步化，將細胞用0.25%培養(yǎng)基中消化2 min，棄上清，加入2 ml血清培養(yǎng)基后吹打至細胞分散后，1 500 r/min（離心半徑6 cm，下同）離心5 min，收集沉淀，加入含抗生素及血清的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細胞濃度至1.5×102μl－1接種至96孔板，每孔200 μl。試驗分為A、B、C、D組，各組細胞均在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h至細胞貼壁。A組為正常對照，于常氧環(huán)境中培養(yǎng)；B、C、D組細胞于3%O2-5%CO2-92%N2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h制備缺氧損傷模型［5］。其中C、D組培養(yǎng)前加入前列地爾使其在培養(yǎng)液中質(zhì)量濃度為15、45 μg/L［6］，A、B組培養(yǎng)前加入無血清培養(yǎng)液，各孔中液體體積為（200±20）μl。

2.3 指標檢測

2.3.1 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài) 各組細胞培養(yǎng)48 h后，將96孔板直接置于倒置熒光顯微鏡（放大100倍）下觀察，比較各組細胞形態(tài)的變化，并拍照。

2.3.2 MTT比色法檢測細胞活力 各組細胞均棄去上清液，每組設12個復孔，設置空白對照孔（無細胞）調(diào)零，加入200 μl無血清培養(yǎng)液及20 μl的MTT+磷酸鹽緩沖液（PBS）（5 g/L），于37 ℃下孵育4 h并終止培養(yǎng)。棄上清后每孔加入150 μl的DMSO，振蕩10 min，分別用酶標儀于490 nm波長處測定細胞培養(yǎng)0、6、12、24 h后的吸光度（A），繪制細胞生存曲線。

2.3.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 用胰蛋白酶分別消化及收集各組細胞，每個樣本調(diào)細胞數(shù)為1×109～5×109個，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用500 μl PBS重懸細胞。每個樣本中分別加入5 μl AnnexinⅤ-FIFC和10μl碘化丙啶（PI），避光搖勻后黑暗中室溫孵育5 min，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。

2.3.4 Western blot法檢測細胞中VEGF及eNOS表達 取各組細胞，加入裂解液，蛋白定量后采用Western blot法檢測VEGF及eNOS表達水平，操作嚴格按照說明書進行：裂解細胞后獲取總蛋白，將蛋白定量后經(jīng)十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、轉膜、封閉、切膜后分別加入1∶500的小鼠抗人VEGF抗體及1∶500的小鼠抗人eNOS抗體和1∶2 000的小鼠抗人β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，洗滌后加入HRP標記的羊抗鼠多克隆抗體，室溫孵育1.5 h后洗膜，電化學發(fā)光（ECL）試劑盒曝光顯影。以目標條帶與內(nèi)參β-actin條帶的比值作為目標蛋白相對表達量，試驗重復3次。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示。采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 細胞形態(tài)

A、D組細胞的密度較高，細胞生長接近亞融合狀態(tài)，呈短梭形生長，排列呈鋪路石狀；B組細胞密度較低，部分細胞呈空泡狀，表現(xiàn)出損傷；C組細胞密度較低，損傷不明顯。各組細胞的形態(tài)圖見圖1。

圖1 各組細胞的形態(tài)圖（×100）Fig 1 Morphology of cells in each group（×100）

3.2 細胞活力與凋亡率

與A組比較，B、C、D組細胞活力降低，凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各組細胞的生存曲線見圖2，培養(yǎng)24 h時的A值和凋亡率檢測結果見表1。

圖2 各組細胞的生存曲線Fig 2 Survival curves of cells in each group

表1 各組細胞的A值和凋亡率檢測結果（±s，n=12）Tab 1 Detection results of A value and apoptosis rate of cells in each group（±s，n=12）

表1 各組細胞的A值和凋亡率檢測結果（±s，n=12）Tab 1 Detection results of A value and apoptosis rate of cells in each group（±s，n=12）

注：與A組比較，＊P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05；與C組比較，☆P＜0.05Note：vs.group A，＊P＜0.05；vs.group B，#P＜0.05；vs.group C，☆P＜0.05

凋亡率，% 13.09±1.17 17.92±1.42＊16.25±1.33＊15.09±1.27＊#☆11.021 ＜0.05組別A組B組C組D組A值F P 0.57±0.02 0.46±0.04＊0.51±0.03＊#0.52±0.02＊#8.814 ＜0.05

3.3 細胞中VEGF和eNOS表達

與A組比較，B、C、D組細胞中VEGF和eNOS的表達增強，eNOS/VEGF減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與B組比較，C組細胞中VEGF表達減弱，D組細胞中VEGF和eNOS的表達減弱、eNOS/VEGF增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與C組比較，D組細胞的eNOS/VEGF增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各組細胞中VEGF、eNOS表達的電泳圖見圖3，檢測結果見表2。

圖3 各組細胞中VEGF、eNOS表達的電泳圖Fig 3 Electropherogram of the expressions of VEGF and eNOS of cells in each group

表2 各組細胞中VEGF、eNOS表達及eNOS/VEGF的檢測結果（±s，n=12）Tab 2 Detection results of expressions of VEGF and eNOS and eNOS/VEGF of cells in each group（±s，n=12）

表2 各組細胞中VEGF、eNOS表達及eNOS/VEGF的檢測結果（±s，n=12）Tab 2 Detection results of expressions of VEGF and eNOS and eNOS/VEGF of cells in each group（±s，n=12）

注：與A組比較，＊P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05；與C組比較，☆P＜0.05Note：vs.group A，＊P＜0.05；vs.group B，#P＜0.05；vs.group C，☆P＜0.05

eNOS/VEGF 0.92±0.38 0.53±0.19＊0.59±0.21＊0.73±0.27＊#☆10.264 ＜0.05組別A組B組C組D組F P VEGF/β-actin 0.08±0.02 0.59±0.11＊0.42±0.09＊#0.29±0.02＊#☆9.876 ＜0.05 eNOS/β-actin 0.07±0.04 0.31±0.12＊0.25±0.03＊0.22±0.04＊#11.021 ＜0.05

4 討論

缺氧可以引起肺血管強烈收縮及血管平滑肌細胞大量增生，促進肺動脈高壓的發(fā)生。近些年研究發(fā)現(xiàn)，缺氧引起的多種血管活性物質(zhì)平衡失調(diào)在肺動脈高壓的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用［6-7］。既往研究發(fā)現(xiàn)，前列地爾注射液預處理對局部腦缺血模型的大鼠具有保護作用，其機制可能通過下調(diào)大腦皮層的誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）、上調(diào)eNOS有關［8-9］。肺是前列地爾代謝最強及作用最明顯的器官，研究認為前列地爾主要通過緩解肺血管局限性狹窄、擴張肺動脈、增加遠端肺血流、改善肺通氣/血流比，從而達到降低肺動脈壓的作用［10］，但前列地爾對肺部微血管細胞的保護作用目前無明確研究。

本次研究參照陳小菊等［5］的方法，采用三氣培養(yǎng)箱，以3% O2-5%CO2-92%N2環(huán)境建立缺氧損傷模型，結果表明前列地爾對缺氧損傷HPMECs細胞具有保護作用。

VEGF與eNOS在缺氧導致的肺微血管損傷中發(fā)揮的作用不同：VEGF可以導致血管內(nèi)皮細胞增殖，促進肺動脈高壓的進展；eNOS可以通過合成NO擴張血管，抑制肺動脈高壓的進展。既往研究發(fā)現(xiàn)，缺氧對VEGF的表達具有重要的意義，細胞缺氧培養(yǎng)幾小時內(nèi)VEGF的表達水平即可明顯增高；在體研究發(fā)現(xiàn)，缺氧對心、腦、肝、腎等組織的VEGF表達具有強烈的誘導作用［11-12］。eNOS主要表達在大、中血管的內(nèi)皮細胞上，故正常培養(yǎng)時，肺微血管內(nèi)皮細胞的eNOS的表達水平較低；缺氧狀態(tài)下，組織的eNOS表達水平升高，小血管及微血管內(nèi)也可出現(xiàn)eNOS的表達［13］。故本次研究分別對eNOS、VEGF及二者比值進行分析，發(fā)現(xiàn)前列地爾對缺氧損傷HPMECs中 VEGF、eNOS的過度表達具有抑制作用。其中eNOS的結果與既往的研究結果不相符，如包翠芳等［14］研究發(fā)現(xiàn)前列地爾可以下調(diào)缺氧大鼠大腦皮層的iNOS并上調(diào)eNOS，其原因可能是本次研究主要采用離體試驗的方法，與在體實驗存在差異。此外，缺氧可能主要通過改變細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，導致eNOS表達反應性升高［15］。

綜上所述，前列地爾可能通過上調(diào)HPMECs的eNOS/ VEGF發(fā)揮保護作用。

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Effects of Alprostadil on the Expression of VEGF and eNOS in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells with Hypoxia-induced Injury

WANG Youjun，ZHANG Lingmei（Dept.of Infectious，the Hospital Affiliated of Laiwu Iron and Steel Group Co.，Ltd.，Shandong Laiwu 271126，China）

OBJECTIVE：To study the effects of alprostadil on the expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）and endothelial nitric oxide synthase（eNOS）in human pulmonary microvascular endothelial cells（HPMECs）with hypoxia-induced injury.METHODS：HPMECs were divided into group A（normal cultural environment），group B（3%O2），group C（3% O2+15 μg/L alprostadil）and group D（3%O2+45 μg/L alprostadil）for 24 h culture.Cell morphology was observed；MTT method was conducted to detect cell activity（recorded by absorbance）；flow cytometry was adopted to detect apoptosis rate；Western blot was used to detect relative expressions of VEGF and eNOS in cells.RESULTS：Cell density in group A and D was relatively high，that in group B and C was low.Compared with group A，cell activities decreased and apoptosis rates increased in group B，C and D，expressions of VEGF and eNOS enhanced，eNOS/VEGF decreased（P＜0.05）.Compared with group B，cell activities increased in group C and D，VEGF expression decreased（P＜0.05）；apoptosis rate in group D decreased，eNOS expression decreased and eNOS/VEGF increased.Compared with group C，cell apoptosis rate was decreased in group D，VEGF expression decreased and eNOS/VEGF increased（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Alprostadil maybe play effect on HPMECs with hypoxia-induced injury by up-regulating the expression level of eNOS/VEGF.

Alprostadil；Hypoxia-induced injury；Human pulmonary microvascular endothelial cells；Vascular endothelial growth factor；Endothelial nitric oxide synthase

R965

A

1001-0408（2016）25-3518-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.19

2016-03-07

2016-04-11）

＊副主任醫(yī)師。研究方向：傳染病的治療。E-mail：lgwangxinyan@126.com