丹參多酚酸鹽對肺癌模型小鼠肺組織中VEGF和MMP-9表達的影響

周生余，張發艷（1.山東大學護理學院臨床教研室，濟南 5001；.山東中醫藥大學中醫學院生理教研室，濟南 50355）

丹參多酚酸鹽對肺癌模型小鼠肺組織中VEGF和MMP-9表達的影響

周生余1＊，張發艷2（1.山東大學護理學院臨床教研室，濟南 250012；2.山東中醫藥大學中醫學院生理教研室，濟南 250355）

目的：研究丹參多酚酸鹽對肺癌模型小鼠肺組織中血管內皮生長因子（VEGF）和基質金屬蛋白酶9（MMP-9）表達的影響。方法：取C57BL/6小鼠隨機分為模型組（生理鹽水）、陽性對照組（環磷酰胺50 mg/kg）和丹參多酚酸鹽低、中、高劑量組（20、40、80 g/kg），每組10只。小鼠ip烏拉坦1 000 mg/kg，每周2次，連續4周建立肺癌模型；建模后各組小鼠ip相應藥物，每日1次，連續給藥14 d。比較各組小鼠行為、體征、體質量、抑瘤率、脾臟系數、胸腺系數及肺組織中血管內皮生長因子（VEGF）和基質金屬蛋白酶9（MMP-9）表達。結果：模型組小鼠活動度消失，毛色暗淡無光澤，喜扎堆；陽性對照組和丹參多酚酸鹽各劑量組小鼠上述現象均好轉。陽性對照組和丹參多酚酸鹽低、中、高劑量組小鼠的體質量分別為（21.01±2.95）g、（20.89±3.14）g、（21.03±3.02）g、（21.24±3.17）g，抑瘤率分別為（41.12±15.42）%、（36.92±10.42）%、（39.41±12.39）%、（37.19±10.39）%；與模型組比較，其余4組小鼠的脾臟系數、胸腺系數、VEGF（陽性對照組除外）和MMP-9表達均明顯降低（P＜0.05）。結論：丹參多酚酸鹽對肺癌模型小鼠有明顯的抑瘤作用，其作用機制可能與抑制VEGF和MMP-9表達相關。

丹參多酚酸鹽；肺癌；小鼠；抑瘤率；血管內皮生長因子；基質金屬蛋白酶9

肺癌是常見的一種惡性腫瘤。近年來流行病學調查研究發現肺癌發病率呈上升趨勢，死亡原因主要在于遠處轉移和局部浸潤，致使患者喪失治愈的機會［1-2］。丹參已廣泛應用于臨床治療腫瘤，其主要成分丹參酮具有明顯的抗腫瘤及促進腫瘤浸潤淋巴細胞的體外擴增作用［3］。丹參多酚酸鹽是由丹參中提取的多酚酸鹽類化合物制備成的一類化合物，以丹參乙酸鎂為主要成分。近年來研究表明，血管內皮生長因子（VEGF）和基質金屬蛋白酶9（MMP-9）與肺癌預后有一定的相關性，且具有促進腫瘤浸潤轉移的作用［4］。為了解丹參多酚酸鹽對惡性腫瘤的轉移是否具有影響，本研究探討了不同濃度丹參多酚酸鹽對肺癌模型小鼠肺組織中VEGF和MMP-9表達的影響，以期為臨床提供一定的參考。

1 材料

1.1 儀器

Olympus生物顯微鏡（日本Olympus公司）；TGL-160臺式高速離心機（上海醫用分析儀器廠）；Leica切片機（德國Leica公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用丹參多酚酸鹽（上海綠谷制藥有限公司，批號：20140824，規格：每支50 mg，含丹參乙酸鎂40 mg）；注射用環磷酰胺（山西普德藥業股份有限公司，批號：20140919，規格：每支50 mg）；烏拉坦片（武漢勝天宇生物科技有限公司，批號：20141227，規格：每片0.5 g）；VEGF、MMP-9免疫組化檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：201206、201211）。

1.3 動物

C57BL/6小鼠50只，♂，6～8周齡，體質量（18±2）g；飼養2周，室溫23～25 ℃，濕度為70%，自由飲水和攝食。小鼠購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號為SYXK（瀘）2010-0095。

2 方法

2.1 肺癌模型的建立

將小鼠實驗室適應性飼養2周后，ip烏拉坦（采用生理鹽水配制）1 000 mg/kg，每周2次，連續4周。

2.2 分組與給藥

將50只小鼠隨機分為模型組、陽性對照組和丹參多酚酸鹽低、中、高劑量組，每組10只。于造模成功后，丹參多酚酸鹽低、中、高劑量組小鼠分別按20、40、80 g/kg ip相應的丹參多酚酸鹽，陽性對照組小鼠ip 50 mg/kg的環磷酰胺，模型組小鼠ip相同劑量的生理鹽水，每日給藥1次，連續給藥14 d。丹參多酚酸鹽低、中、高劑量組的給藥劑量分別由成人臨床日用量的4.5、9、18倍換算而得，陽性對照組給藥劑量參照文獻［5］。

2.3 觀察指標

2.3.1 行為和體征 于給藥期間每日8：30－9：30觀察各組小鼠的行為、體征，觀察14 d。

2.3.2 體質量與抑瘤率 分別于造模4周后稱量各組小鼠體質量；分別于給藥14 d后以頸椎脫臼法處死小鼠，取瘤組織，稱瘤質量，計算抑瘤率，抑瘤率=（1－給藥組平均瘤質量/模型組平均瘤質量）×100%。

2.3.3 臟器系數 取各組小鼠的脾臟、胸腺并稱質量，計算臟器系數，臟器系數=臟器質量/去瘤體質量（其中，去瘤體質量指去除瘤體后小鼠體質量）。

2.3.4 肺組織中VEGF和MMP-9表達 將肺轉移瘤灶用4%甲醛固定12 h后，采用石蠟包埋，根據免疫組化檢測試劑盒說明書標準操作，測定各組小鼠肺組織中VEGF和MMP-9表達。采用Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件分析高清晰度彩色病理圖文報告進行定量，在400倍顯微鏡下，每張切片隨機選取5個視野，計算陽性面積的比例，取平均值。

2.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析。處理數據多個樣本均數比較采用單因素方差分析（ANOVA），多組間計量資料采用F檢驗，計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義，檢驗標準α=0.05。

3 結果

3.1 行為和體征觀察結果

小鼠造模4周后成瘤率率100%。模型組小鼠給藥7 d后活動度減少，14 d后毛色暗淡無光澤，且喜扎堆。陽性對照組小鼠給藥7 d后活動度較模型組明顯增加，14 d后毛色無暗淡現象。與模型組比較，丹參多酚酸鹽各劑量組小鼠給藥7 d后活動能力下降不明顯，且至14 d仍未出現毛發卷曲和毛色暗淡現象。

3.2 體質量和抑瘤率測定結果

丹參多酚酸鹽各劑量組和陽性對照組小鼠的體質量和抑瘤率差異無統計學意義（P＞0.05）。各組小鼠體質量、抑瘤率的檢測結果見表1。

表1 各組小鼠體質量、抑瘤率的測定結果（±s，n=10）Tab 1 Detection results of body weight and tumor inhibition rate of mice in each group（±s，n=10）

表1 各組小鼠體質量、抑瘤率的測定結果（±s，n=10）Tab 1 Detection results of body weight and tumor inhibition rate of mice in each group（±s，n=10）

抑瘤率，% 36.92±10.42 39.41±12.39 37.19±10.39 41.12±15.42組別模型組丹參多酚酸鹽低劑量組丹參多酚酸鹽中劑量組丹參多酚酸鹽高劑量組陽性對照組體質量，g 20.71±2.89 20.89±3.14 21.03±3.02 21.24±3.17 21.01±2.95

3.3 脾臟系數和胸腺系數測定結果

與模型組比較，各給藥組小鼠的脾臟系數和胸腺系數均明顯降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，丹參多酚酸鹽各劑量組小鼠的脾臟系數和胸腺系數均明顯升高（P＜0.05）；與丹參多酚酸鹽低、高劑量組比較，丹參多酚酸鹽中劑量組小鼠的脾臟系數和胸腺系數明顯降低（P＜0.05），結果見表2。

表2 各組小鼠脾臟系數和胸腺系數的測定結果（±s，n= 10）Tab 2 Detection results of spleen index and thymus index of mice in each group（±s，n=10）

表2 各組小鼠脾臟系數和胸腺系數的測定結果（±s，n= 10）Tab 2 Detection results of spleen index and thymus index of mice in each group（±s，n=10）

注：與模型組比較，＊P＜0.05；與陽性對照組比較，#P＜0.05；與丹參多酚酸鹽低、高劑量組比較，ΔP＜0.05Note：vs.model group，＊P＜0.05；vs.positive control group，#P＜0.05；vs.salvianolate low-dose group and high-dose group，ΔP＜0.05

胸腺指數，mg/g 0.71±0.06 0.63±0.05＊#0.41±0.04＊#Δ0.52±0.06＊#0.34±0.04＊組別模型組丹參多酚酸鹽低劑量組丹參多酚酸鹽中劑量組丹參多酚酸鹽高劑量組陽性對照組脾臟指數，mg/g 10.39±1.39 8.47±0.89＊#7.31±0.76＊#Δ7.92±0.82＊#6.03±1.34＊

3.4 肺組織中VEGF和MMP-9表達測定結果

與模型組比較，各給藥組小鼠肺組織中VEGF（陽性對照組除外）、MMP-9表達均明顯降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，丹參多酚酸鹽各劑量組小鼠肺組織中VEGF和MMP-9表達更低（P＜0.05）；與丹參多酚酸鹽低、高劑量組比較，丹參多酚酸鹽中劑量組小鼠肺組織中VEGF和MMP-9表達最低（P＜0.05），結果見表3。

表3 各組小鼠肺組織中VEGF、MMP-9表達的測定結果（±s，n=10）Tab 3 Detection results of VEGF and MMP-9 expressions of mice lung tissue in each group（±s，n=10）

表3 各組小鼠肺組織中VEGF、MMP-9表達的測定結果（±s，n=10）Tab 3 Detection results of VEGF and MMP-9 expressions of mice lung tissue in each group（±s，n=10）

注：與模型組比較，＊P＜0.05；與陽性對照組比較，#P＜0.05；與丹參多酚酸鹽低、高劑量組比較，ΔP＜0.05Note：vs.model group，＊P＜0.05；vs.positive control group，#P＜0.05；vs.salvianolate low-dose group and high-dose group，ΔP＜0.05

MMP-9，% 7.13±0.93 6.25±0.78＊#5.34±0.72＊#Δ5.82±0.83＊#8.49±1.23＊組別模型組丹參多酚酸鹽低劑量組丹參多酚酸鹽中劑量組丹參多酚酸鹽高劑量組陽性對照組VEGF，% 7.59±0.76 6.81±0.68＊#6.13±0.53＊#Δ6.59±0.60＊#7.69±0.87

4 討論

肺癌模型大致可分為轉基因模型、移植性腫瘤模型、誘發性腫瘤模型以及自發性腫瘤模型，這些腫瘤模型各有利弊［5］。其中轉基因模型主要是通過基因工程將外源特定基因導入動物細胞的染色體內，其特點主要是外源腫瘤基因可遺傳給后代，從基因水平研究腫瘤的演進、發展及形成，但單基因腫瘤發病機制與臨床不相符，且來源有限、建立技術要求較高［6］。移植性腫瘤模型是目前應用相對較多的一種腫瘤模型，將癌細胞或腫瘤組織移植至動物體內形成腫瘤，具有個體差異小、生長速率一致、周期短等特點，且接種率達100%；該方法常用于篩選抗腫瘤新藥，但采用該法具有腫瘤生長速度快、體積倍增時間短、增殖比率高等缺點［7］。誘發性腫瘤模型是用病毒、射線、化學致癌物等在動物中誘發腫瘤，其誘發的腫瘤與人體腫瘤較為相似，但該法致癌物和動物的選擇對腫瘤模型尤為重要，還存在潛伏期個體變異大、周期長、成功率達不到100%等缺點［8-9］。自發性腫瘤模型是在自然情況下發生，與人類腫瘤最為類似，但該法具有周期長、耗資大、動物樣本量大、腫瘤發生率低等缺點［10］。目前，已有很多研究將誘發性肺癌小鼠模型應用于臨床，包括肺內注射致癌物誘發肺癌、口服致癌劑誘發肺癌以及吸入致癌物質誘發肺癌等。常用肺癌模型致癌物包括烏拉坦、巰甲基尿嘧啶、苯并芘、乙酰胺基氟、二乙基亞硝胺等，這些藥物均可成功誘發肺癌，其中烏拉坦可100%誘導肺癌模型［11］。故筆者在本研究中選用烏拉坦誘導小鼠肺癌模型，結果顯示，成瘤率達100%。

丹參多酚酸鹽是由中藥丹參中提取精制的一種水溶性多酚酸鹽類化合物制備而成的一類化合物。丹參水溶性提取物具有清除自由基、抗脂質過氧化、促進組織恢復、抗血栓以及改善微循環等廣泛的藥理作用［12］。丹參對腫瘤細胞具有細胞毒作用、增殖抑制作用以及誘導腫瘤細胞凋亡和誘導分化作用［13］。VEGF是由學者Ferrara N 1989年發現的一種血管生成調節因子，該因子主要由腫瘤細胞分泌，其生物活性功能主要通過與VEGF受體結合產生。早期學者研究發現，VEGF主要通過與內皮細胞上的VEGF受體結合，通過旁分泌機制增加新生血管通透性以及促進腫瘤新生血管的生成［14］。近年來研究報道表明，很多腫瘤細胞上也存在VEGF受體表達，并且VEGF還能夠經自分泌機制促進腫瘤的浸潤轉移，但目前對其具體機制尚不十分清楚，認為可能與VEGF調節腫瘤細胞組織因子、MMPs及整合素等相關［15］。MMPs是Zn2+依賴的一類細胞外蛋白質水解酶，其能夠降解細胞外基質的所有成分，而其中細胞外基質降解是腫瘤細胞浸潤、遷移基質的前提，MMP-9是其中一種重要的MMP蛋白［16］。本文研究結果顯示，與模型組和陽性對照組比較，丹參多酚酸鹽各劑量組小鼠肺組織中VEGF和MMP-9表達明顯降低，其中中劑量組效果最明顯（P＜0.05），但其具體原因尚不十分清楚，有待進一步研究。

綜上所述，丹參多酚酸鹽對肺癌模型小鼠有明顯的抑瘤作用，其作用機制可能與抑制VEGF和MMP-9表達相關。

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Effects of Salvianolate on the Expression of VEGF and MMP-9 in Lung Tissue of Mice with Lung Cancer

ZHOU Shengyu1，ZHANG Fayan2（1.Dept.of Clinical Laboratory，College of Nursing，Shandong University，Jinan 250012，China；2.Dept.of Physiology Laboratory，College of Traditional Chinese Medicine，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China）

OBJECTIVE：To study the effects of salvianolate on the expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）and matrix metalloproteinase-9（MMP-9）in lung tissue of mice with lung cancer.METHODS：C57BL/6 mice were randomly divided into model group（normal saline），positive control group（cyclophosphamide 50 mg/kg）and salvianolate low-dose，mediumdose and high-dose groups（20，40，80 g/kg）with 10 mice in each group.They were ig 1 000 mg/kg urethane，twice a day，for consecutive 4 weeks to establish lung cancer model.After modeling，they were given relevant medicine intragastrically once a day for consecutive 14 d.Mice behaviors，symptoms，body weight，tumor inhibition rate，spleen index，thymus index，and the expressions of VEGF and MMP-9 in lung tissue among groups were compared.RESULTS：The activity of mice in model group disappeared，dull coat color，preferred crowding together；the above-mentioned phenomenon improved in positive control group and salvianolate different dose groups.The body weight of mice in positive control group，salvianolate low-dose group，medium-dose group and high-dose group were（21.01±2.95）g，（20.89±3.14）g，（21.03±3.02）g，（21.24±3.17）g；and the tumor inhibition rates were（41.12±15.42）%，（36.92±10.42）%，（39.41±12.39）%and（37.19±10.39）%；compared with model group，spleen index，thymus index，and the expressions of VEGF（except for positive control group）and MMP-9 in other 4 groups decreased （P＜0.05）.CONCLUSIONS：Salvianolate shows obvious inhibitory effects on mice with lung cancer，which may be related to inhibiting expressions of VEGF and MMP-9 in lung tissue.

Salvianolate；Lung cancer；Mice；Tumor inhibition rate；Vascular endothelial growth factor；Matrix metalloproteinases-9

R965

A

1001-0408（2016）25-3515-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.18

2016-01-28

2016-05-15）（編輯：鄒麗娟）

＊副主任醫師，博士。研究方向：肺部腫瘤與凝血異常。E-mail：zloe908@163.com