大棗神經保護作用的活性組分篩選及其作用機制研究Δ

陳劍平，李中桂，張尚斌#，鄭 平，董婷霞，詹華強（.深圳市中醫院深圳市醫院中藥制劑研究重點實驗室，廣東深圳 58033；.香港科技大學中藥研發中心，香港）

大棗神經保護作用的活性組分篩選及其作用機制研究Δ

陳劍平1＊，李中桂1，張尚斌1#，鄭 平1，董婷霞2，詹華強2（1.深圳市中醫院深圳市醫院中藥制劑研究重點實驗室，廣東深圳 518033；2.香港科技大學中藥研發中心，香港）

目的：篩選大棗神經保護作用的活性組分，并初步闡明其作用機制。方法：以大棗多糖富集組分（1 mg/ml）、大棗多糖去除組分（1 mg/ml）、7種大棗黃酮類成分（兒茶素、原花青素B2、表兒茶素、金絲桃苷、蘆丁、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷，記為A、B、C、D、E、F、G，濃度均為3、13、30μmol/L）和2種大棗核苷類成分（環磷酸腺苷、環磷酸鳥苷，濃度均為3、13、30 μmol/L）分別培養類神經細胞（PC12細胞）24 h后，以叔丁基過氧化氫（tBHP，150μmol/L）作用于PC12細胞3 h誘導細胞氧化損傷，MTT法檢測PC12細胞的存活率。按上述方法培養轉染了報告基因質粒（pARE-Luc）的PC12細胞24 h，采用熒光素酶（Luc）法檢測各組細胞中抗氧化元件（ARE）的轉錄水平（以Luc活性反映），以考察各組分抗損傷機制。結果：大棗多糖富集組分能顯著提高氧化損傷PC12細胞的存活率，升高轉染細胞內ARE轉錄水平。大棗所含的黃酮類成分中A（30μmol/L）、B（3～30μmol/L）和C （10～30μmol/L）均能顯著高細胞存活率，且A（30μmol/L）、B（3～30μmol/L）、C（30μmol/L）、E（30μmol/L）和F（3～30μmol/L）能顯著提高轉染細胞內ARE轉錄水平。大棗中核苷類成分環磷酸腺苷和環磷酸鳥苷則無明顯提高氧化損傷PC12細胞存活率和和轉染細胞內ARE轉錄水平的作用。結論：大棗多糖類成分和大棗黃酮類成分可能是大棗神經保護作用的活性組分，且其作用機制可能與激活ARE轉錄相關。

大棗；神經保護；PC12細胞；大棗多糖去除組分；大棗多糖富集組分；抗氧化元件；大棗黃酮；大棗核苷

大棗為鼠李科植物棗（Ziziphus jujuba Mill.）的干燥成熟果實，具有補中益氣、養血安神的功效［1］。近年研究不斷證實了大棗的神經保護作用，如減輕長爪沙鼠海馬組織的缺血性損傷、提高腦內腦源性神經營養因子水平、抗驚厥和改善大鼠認知障礙等［2-3］。但目前國內外對大棗神經保護方面的研究大部分停留在功效分析上，缺乏對其有效物質基礎的研究。據文獻報道，大棗水提物中主要成分為核苷類、黃酮類和多糖類3種［4-7］。其中，核苷類成分具有抗血小板凝聚和抗心律失常等功效［8-9］，黃酮類成分具有抗氧化和抗炎等作用［10-12］，多糖類成分則具有增強免疫功能、造血功能和抗氧化等作用［13-15］。而關于這3類成分在神經系統方面作用研究鮮有報道。

近年來，關于氧化應激與神經性疾病的相關性假說引起了相關學者的高度關注。類神經細胞——PC12細胞被廣泛用于評價藥物基于氧化損傷或其他損傷的神經保護作用中，筆者前期已經利用該細胞成功建立了基于抗氧化反應元件（ARE）的抗氧化作用評價模型［6，16］。在本實驗中，筆者在前期建立的模型基礎上進一步研究大棗中上述3類組分在神經系統中的作用，初步闡明大棗神經保護作用的物質基礎。

1 材料

1.1 儀器

FLUOstar OPTIMA型全自動多功能酶標儀（德國BMG Labtech公司）；Sartorius BP 211D型電子天平（十萬分之一，德國Sartorius公司）；CQ-250-DST型超聲波清洗機（上海躍進醫用光學器械廠）。

1.2 藥材、對照品、載體與試劑

大棗藥材采自河北滄州，由香港科技大學中藥研發中心董婷霞博士鑒定為鼠李科植物棗（Ziziphus jujuba Mill.）的干燥成熟果實；兒茶素（批號：E-0102）、原花青素B2（批號：E-0511）、表兒茶素（批號：E-0113）、金絲桃苷（批號：E-0193）、蘆?。ㄅ枺篍-0124）、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷（批號：E-0741）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號：E-0798）對照品均購自上海同田生物技術股份有限公司，純度均高于98%；環磷酸腺苷（cAMP，批號：A9501）、環磷酸鳥苷（cGMP，批號：G7504）、維生素C （VC，批號：1043003）、叔丁基氫醌（tBHQ，批號：112941）對照品均購自美國Sigma公司，純度均高于98%；大棗多糖富集組分和大棗多糖去除組分由香港科技大學中藥研發中心提取、富集制得；熒光素酶（Luc）檢測試劑盒（批號：BC100L）購自美國應用生物系統中國公司；pGL4.37［luc2P/ARE/Hygro］啟動子報告載體［包含4個重復的ARE，序列為5′-TAGCTTGGAAATGACATTGCTAATGGTGACAAAGCA-ACTTT-3′，ARE可激活Luc報告基因luc2P的轉錄］、報告基因質粒（PARE-Luc）購自美國Promega Corporation公司；其余試劑均為分析純。

1.3 細胞株

大鼠嗜鉻細胞瘤細胞株PC12細胞購于美國ATCC公司。

2 方法

2.1 大棗多糖富集組分與大棗多糖去除組分的制備

取大棗藥材80 g，加20倍量水，煎煮2次，每次1 h，濾過，合并2次濾液。濾液加4倍量乙醇沉淀，于4 ℃條件下放置過夜，離心，分取上清液和沉淀物，分別干燥，即得大棗多糖去除組分（2.88 g）和大棗多糖富集組分（58.19 g）。

2.2 大棗中各組分及其他試劑溶液的制備

取兒茶素、原花青素B2、表兒茶素、金絲桃苷、蘆丁、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、cAMP、cGMP對照品適量，精密稱定，分別溶于二甲基亞砜（DMSO）溶液中，振搖使其充分溶解，分別制備成濃度為100 mmol/L的貯備液；取大棗多糖富集組分和大棗多糖去除組分適量，精密稱定，分別溶于水中，振搖使其充分溶解，分別制備成質量濃度為50、100 mg/ml的貯備液。以上貯備液均貯存在4 ℃冰箱中，臨用前根據試驗情況再用DMEM培養基進行稀釋。

2.3 細胞培養[16]

將PC12細胞加至含6%胎牛血清、6%馬血清、100 u/ml青霉素以及100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中，然后再置于溫度為37 ℃、含7.5%CO2和一定濕度的培養箱中培養。

2.4 大棗各組分對神經細胞的保護作用

將PC12細胞接種到96孔板中，每孔約2×104個細胞，過夜讓細胞貼壁。第2天開始取“2.2”項下的大棗不同組分貯備液分別用DMEM培養基稀釋，使大棗多糖富集物組分、大棗多糖去除組分質量濃度均為1 mg/ml，各對照品濃度分別為3、10、30 μmol/L，分別加入培養的細胞中，作為給藥組；同法加入相同體積的DMEM培養基作為空白組。培養24 h后，各孔均加入tBHP溶液（氧化應激誘導劑，150 μmol/L）3 h誘導細胞損傷，再加入MTT溶液（0.5 mg/ml），繼續培養1 h后終止培養。小心吸棄孔內培養液，每孔加入150μl DMSO溶液，在避光條件下置于搖床上低速振蕩15 min，使結晶充分溶解。采用酶標儀于570 nm波長處測量各孔的吸光度（A），其中空白組的吸光度為A0、給藥組的吸光度為AS。并計算細胞的存活率：存活率（%）=1－（1－AS）/（1－A0）×100%。試驗重復3次，結果以3次試驗結果的平均值來表示。同時，以VC（1 mmol/L）為陽性對照，同法測定細胞的存活率。

2.5 大棗各組分對轉染細胞ARE轉錄的激活作用

通過Lipofectamine 2000轉染技術，將報告基因質粒（pARE-Luc）轉染到培養的PC12細胞中，將轉染后的PC12細胞接種在24孔板中，每孔約5×105個細胞，過夜讓細胞貼壁。從第2天開始，給藥組分別按“2.4”項下方法給藥，空白組加入相同體積的細胞培養液。給藥24 h后取樣，按Luc試劑盒說明書操作進行Luc轉錄活性分析（以此反映細胞內ARE轉錄水平）。熒光發光反應通過全自動多功能酶標儀進行定量，活性大小采用吸光度（測定波長為560 nm）表示，其中空白組吸光度為A0、給藥組為AS，計算相對Luc活性：相對Luc活性（%）= （AS/A0－1）×100%。試驗重復3次，結果以3次試驗結果的平均值來表示。同時以tBHQ（2 μmol/L）為陽性對照，同法測定其對Luc活性的影響。

2.6 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件處理試驗數據。組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大棗各組分對神經細胞的保護作用測定結果

3.1.1 大棗多糖富集組分與大棗多糖去除組分對神經細胞的保護作用 在相同質量濃度下（1 mg/ml），大棗多糖富集組分能顯著減輕由tBHP誘導的神經細胞氧化損傷，細胞存活率為30%，但效果明顯不及VC；而在大棗多糖去除組分作用下，細胞存活率約為10%，與大棗多糖富集組分比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果提示，大棗多糖組分可能是大棗神經保護作用的活性組分之一。大棗多糖富集組分和大棗多糖去除組分作用后細胞存活率測定結果見圖1。

3.1.2 大棗黃酮類組分和核苷類組分對神經細胞的保護作用 兒茶素（30 μmol/L）、原花青素B2（3、10、30 μmol/L）和表兒茶素（10、30 μmol/L）等均能減輕由tBHP誘導的PC12細胞的氧化損傷，細胞存活率均大于20%，與空白組（細胞存活率為0）比較差異有統計學意義（P＜0.05），但效果不及VC；金絲桃苷、蘆丁、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷的作用相對較弱。另外，cAMP、cGMP也無明顯的保護作用，細胞存活率接近0。結果提示，大棗黃酮類組分也可能是大棗神經保護作用的活性組分之一。大棗黃酮類成分和大棗核苷類成分作用后細胞存活率測定結果見圖2。

圖1 大棗多糖富集組分和大棗多糖去除組分作用后細胞存活率測定結果Fig 1 The cell survival rate after the actions of the ingredient of Z.jujuba with polysaccharide enriched and that with polysaccharide removed

圖2 大棗黃酮類成分和大棗核苷類成分作用后細胞存活率測定結果Fig 2 The cell survival rate after the actions of the flavonoid ingredients and the nucleoside ingredients of Z.jujuba

3.2 大棗各組分對轉染細胞內ARE轉錄的激活作用測定結果

3.2.1 大棗多糖類組分對轉染細胞內ARE轉錄的激活作用 在相同質量濃度（1 mg/ml）下，大棗多糖富集組分能顯著誘導Luc表達，相對Luc活性明顯升高（即ARE轉錄水平升高）；而大棗多糖去除組分則無明顯作用，與大棗多糖富集組分比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結果提示，大棗中多糖類組分的大棗神經保護作用機制與激活細胞內ARE轉錄相關。大棗多糖富集組分和大棗多糖去除組分作用后轉染細胞內相對Luc活性測定結果見圖3。

3.2.2 大棗黃酮類組分和核苷類組分對轉染細胞內ARE轉錄的激活作用 兒茶素（30 μmol/L）、原花青素B2（3、10、30 μmol/L）、表兒茶素（10 μmol/L）、蘆?。?0 μmol/L）和山柰酚-3-O-蕓香糖苷（3、10、30 μmol/L）5個黃酮類成分均能明顯提高Luc活性（即ARE轉錄水平升高），與空白組（相對Luc活性為0）比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而金絲桃苷、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷作用相對較弱。另外，cAMP、cGMP也無顯著激活作用。結果提示，黃酮類組分的神經保護作用機制與激活細胞內ARE轉錄相關。黃酮類成分和核苷類成分作用后轉染細胞內相對Luc活性測定結果見圖4。

圖3 大棗多糖富集組分和大棗多糖去除組分作用后轉染細胞內相對Luc活性測定結果Fig 3 The relative activities of Luc in the transfected cells after the actions of the ingredient of Z.jujuba with polysaccharide enriched and that with polysaccharide removed

圖4 大棗黃酮類成分和大棗核苷類成分作用后轉染細胞內相對Luc活性測定結果Fig 4 The relative activities of Luc in the transfected cells after the actions of the flavonoid ingredients and the nucleoside ingredients of Z.jujuba

4 討論

氧化應激產生的活性氧（ROS）直接或間接地損傷細胞內蛋白質、核酸、脂質等大分子物質的生理功能，有關氧化應激與神經系統疾病的相關性假說越來越受到研究者的重視。Keep-Nrf2-ARE抗氧化信號通路是迄今為止發現的最重要的內源性抗氧化應激通路，其通過調節下游的抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶等蛋白的表達而發揮抗氧化作用。在抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶基因的上游啟動區有一非常保守的基因調控序列，被稱為ARE，調動以上基因的表達主要是通過激活ARE實現的［17］。目前，以ARE為靶序列的細胞水平藥物篩選模型在國內報道相對較少，但相比于經典的抗氧化篩選模型有其獨特的優勢，比如可進行高通量和微量化檢測等。

在前期研究中，筆者發現大棗水提物可抵御tBHP誘導的PC12細胞的氧化損傷，提高氧化損傷PC12細胞的存活率，并且大棗水提取物可激活轉染細胞內ARE的轉錄水平［6］。在本研究中，筆者進一步對大棗神經保護作用的活性組分進行篩選。黃酮類成分目前被認為具有廣泛的抗氧化活性，目前已鑒定出大棗中含有的黃酮類成分有17種［18-19］。本研究選取其中7種主要黃酮成分進行神經細胞抗氧化損傷的評價，發現兒茶素、原花青素B2和表兒茶素等黃酮類成分具有神經保護作用（氧化損傷細胞存活率升高）。大棗多糖作為大棗特異性成分也是目前研究的重點。在抗氧化活性方面，有研究采用陰離子自由基測定方法、羥基自由基清除法等方法考察大棗多糖的抗氧化作用［20］。本文以PC12細胞為研究對象，進一步驗證了大棗多糖的抗氧化作用，其可能也是發揮神經保護作用的有效成分。但是本文只研究了大棗多糖富集組分對神經細胞的保護作用，具體是大棗多糖中哪種多糖成分起作用尚未闡明。另外，本研究結果顯示，核苷類主要成分cAMP、cGMP無明顯的神經保護作用，但是否可通過其他途徑發揮神經保護作用有待進一步考察。

綜上所述，大棗多糖類成分和大棗黃酮類成分可能是大棗神經保護作用的活性組分，且其作用機制與激活ARE轉錄相關。

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Screening for the Active Ingredients of Ziziphus jujuba with Neuroprotective Effects and Their Mechanisms of Action

CHEN Jianping1，LI Zhonggui1，ZHANG Shangbin1，ZHENG Ping1，DONG Tingxia2，ZHAN Huaqiang2（1.Shenzhen Key Laboratory of Hospital TCM Preparation，Shenzhen Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Shenzhen 518033，China；2.Center for Chinese Medicine R&D，the Hong Kong University of Science and Technology，Hong Kong，China）

OBJECTIVE：To conduct screening for the active ingredients of Ziziphus jujuba with neuroprotective effect and to illuminate their mechanisms of action preliminarily.METHODS：After neuron-like cells（PC12 cells）were respectively cultured in the ingredient of Z.jujuba with polysaccharide enriched（1 mg/ml），that with polysaccharide removed（1 mg/ml），7 kinds of flavonoid ingredients of Z.jujuba（catechin，procyanidine B2，epicatechin，hyperoside，rutin，quercetin-3-β-D-glucoside and kaempferol-3-O-rutinoside，represented by A，B，C，D，E，F，G，all at the concentrations of 3，13，30μmol/L）and 2 kinds of nucleoside ingredients of Z.jujuba（cyclic adenosine monophosphate and cyclic guanosine monophosphate，both at the concentrations of 3，13，30μmol/L）for 24 h，tert-butyl hydroperoxide（tBHP，150μmol/L）was used to act on PC12 cells for 3 h to induce oxidative cellular damage，and MTT assay was employed to detect the survival rate of PC12 cells.The PC12 cells transfected with reporter gene plasmid（pARE-Luc）were cultured as above for 24 h，luciferase（Luc）assay was used to detect the transcriptional levels of the antioxidant response element（ARE）of all groups of cells（reflected as the activity of Luc）so as to investigate the anti-injury mechanism.RESULTS：The ingredient of Z.jujuba with polysaccharide enriched could significantly increase the survival rate of PC12 cells to which oxidative damage was caused and the transcriptional level of ARE in the transfected cells.Among the flavonoid ingredients of Z.jujuba，A（30μmol/L），B（3-30μmol/L）and C（10-30μmol/L）could significantly increased the survival rate of the cells，and A（30μmol/L），B（3-30μmol/L），C（30μmol/L），E（30μmol/L）and F（3-30μmol/L）could obviously increased the activation level of ARE in the transfected cells.However，the nucleoside ingredients of Z.jujuba including cyclic adenosine monophosphate and cyclic guanosine monophosphate had no obvious effect of increasing the survival rate of PC12 cells to which oxidative damage was caused or activating the transcription of ARE in the transfected cells.CONCLUSIONS：The polysaccharide and flavonoid ingredients of Z.jujuba may be the active ingredients which account for the neuroprotective effect against oxidative cellular damage，and their mechanisms of action may be related to the activation of ARE transcription.

Ziziphus jujuba；Neuroprotection；PC12 cells；Ingredient of Z.jujuba with polysaccharide removed；Ingredient of Z.jujuba with polysaccharide enriched；Antioxidant response element；Flavonoid of Z.jujuba；Nucleoside of Z.jujuba

R285.5

A

1001-0408（2016）25-3495-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.12

2016-01-14

2016-05-31）

（編輯：林 靜）

深圳市衛生計生系統科研項目（No.201505015）

＊助理研究員，博士。研究方向：中藥藥效物質基礎及質量評價。E-mail：lycjp@126.com

主任中藥師，碩士。研究方向：中藥新藥研究與開發。E-mail：zsb6383@163.com