牡荊素-4′-O-葡萄糖苷在大鼠體內的首關效應研究Δ

吳成舉，柴紀嚴，張文潔（.遼寧中醫(yī)藥大學教學實驗中心，沈陽 003；.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連 60）

牡荊素-4′-O-葡萄糖苷在大鼠體內的首關效應研究Δ

吳成舉1＊，柴紀嚴1，張文潔2（1.遼寧中醫(yī)藥大學教學實驗中心，沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連 116011）

目的：研究牡荊素-4′-O-葡萄糖苷（VG）在大鼠體內的首關效應及其機制，為其新藥劑型研究提供依據(jù)。方法：10只SD大鼠分為肝門靜脈給藥組和股靜脈給藥組，分別于腸系膜上靜脈iv VG、股靜脈灌注VG，通過測定VG在肝臟的AUC計算代謝率；15只SD大鼠分為胃灌注組、腸灌注組和肝門靜脈給藥組，分別于胃底、十二指腸灌注VG及腸系膜上靜脈iv VG，通過測定VG在胃、腸的AUC計算代謝率；15只SD大鼠分為腸灌注組、股靜脈給藥組和生理鹽水組，在給藥前10 min，前2組大鼠灌注細胞色素P450（CYP）3A與P糖蛋白（P-gp）的底物維拉帕米注射液（60 ml/kg），生理鹽水組大鼠灌注等體積生理鹽水，之后按照上述方法給藥，考察維拉帕米對VG腸吸收的影響。結果：VG在肝臟、胃、腸道的代謝率分別為54.9%、1.7%、91.9%；灌注維拉帕米后，腸灌注組大鼠VG的AUC表現(xiàn)出輕微的增加趨勢。結論：肝、腸首關作用是導致VG生物利用度低的主要因素，初步判斷VG是腸道CYP 3A和/或P-gp的底物。

牡荊素-4′-O-葡萄糖苷；首關效應；代謝率；CYP3A；P-糖蛋白；大鼠

山楂葉［1-3］為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥葉，收載于2015年版《中國藥典》（一部）中［4］，具有活血化瘀、理氣通脈之功效，用于改善氣滯血瘀［5-6］、胸悶憋氣、心悸健忘［7-9］、眩暈耳鳴等癥狀［10］。牡荊素-4′-O-葡萄糖苷（VG）是山楂葉中黃酮類的主要活性成分［11］，但文獻報道其生物利用度低［12］。因此，在本研究中筆者復制了大鼠肝臟和胃、腸道首關效應模型并進行相關研究，以解釋其口服生物利用度偏低的原因。此外，腸道內細胞色素P450（CYP）3A的代謝作用和P糖蛋白（P-gp）的外排作用也是影響藥物吸收的主要因素之一［13］，且已有文獻報道黃酮類化合物中的某些成分是CYP3A和P-gp的底物。因此，在本研究中筆者選擇了這2種蛋白酶的共同底物，同時也是誘導劑的維拉帕米［14］，通過觀察VG是否與維拉帕米產生競爭性抑制作用［15］，確定VG是否是腸道CYP 3A和/或P-gp的底物，為其新劑型的開發(fā)奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

1100型高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1310A四元泵、G1312A真空脫氣機、G1314A紫外-可見分光光度計（美國安捷倫公司）；HH-S水浴鍋（上海永光明儀器設備廠）；XYJ80-2型離心機（金壇市金南儀器廠）；TGL-16C型高速臺式離心機（江西醫(yī)療器械廠）；XW-80A型微型旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；ZDHW型電子調溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；動物手術器械、紅外燈、微量取樣器（上海榮泰生化工程有限公司）。

1.2 藥物與試劑

VG對照品（遼寧中醫(yī)藥大學實驗中心實驗室自制，批號：20150207，純度：＞98%）；橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110721-200613，純度：＞98%）；甲醇、乙腈（色譜純，天津市大茂化學試劑廠）；冰醋酸、烏拉坦均為分析純；純化水（娃哈哈有限公司）；鹽酸維拉帕米注射液（天津市中央藥業(yè)有限公司，批號：H12020051，規(guī)格：5 mg∶2 ml）。

1.3 動物

清潔級SD大鼠64只，♂，體質量（250～320）g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXX（遼）2008-0002。實驗期間大鼠自由飲水，給藥前禁食不禁水12 h。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品貯備液的制備 精密稱取VG對照品（批號：20150207）10 mg，置于10 ml量瓶中，用5 ml甲醇超聲（功率：180 W，下同）溶解10 min后稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為1 000 μg/ml的對照品貯備液，于4 ℃冰箱保存，備用。

2.1.2 內標貯備液的制備 精密稱取橙皮苷3.30 mg，置于10 ml量瓶中，用5 ml甲醇超聲溶解10 min后稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為330 μg/ml的內標貯備液，于4 ℃冰箱保存，備用。

2.1.3 空白生物樣品的制備 隨機取SD大鼠24只，分成4組，每組6只，分別用于在股靜脈、肝門靜脈、胃、腸道部位的空白生物樣品制備。實驗前12 h禁食不禁水，ip 20%烏拉坦麻醉，行頸動脈插管術，采集動脈血液，離心（3 000 r/min，離心半徑3.3 cm）15 min，收集血漿，將6只大鼠的血漿混合，于－20℃冰箱保存，備用。

2.1.4 質控（QC）樣品的制備 精密吸取100 μl空白血漿，加入一定濃度的對照品溶液50 μl，按照“2.1.3”項下方法制備質量濃度分別為1.25、10、80 μg/m（l低、中、高質量濃度）的QC樣品，于4 ℃冰箱保存，備用。

2.1.5 生物樣品的預處理 分別取大鼠血漿100 μl，置于2 ml具塞離心試管中，依次加入內標貯備液30 μl、乙酸10 μl、甲醇0.5 ml，渦旋混合1 min，按“2.1.3”項下方法離心15 min，取上清液，于50 ℃氮氣流下吹干，殘渣加入流動相100 μl復溶，渦旋溶解1 min，離心（10 000 r/min，離心半徑3.3 cm）10 min，取上清液20 μl，即得。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Kromasil C1（8150 mm×4.6 mm，5 μm）；預柱：Kromasil C1（835 mm×8.0 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-四氫呋喃-1%冰醋酸水溶液（6∶2∶18∶74，V/V/V/V）；檢測波長：330 nm；流速：1 ml/min；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μl；內標：橙皮苷。在上述色譜條件下，取“2.1.1”～“2.1.3”項下各溶液進樣測定，結果理論板數(shù)以VG計不少于3 000，分離度＞2.0，各成分達到基線分離。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 High performance liquid chromatogram

2.3 線性關系考察

精密吸“2.1.3”項下空白血漿100 μl共7份，依次加入不同質量濃度VG（1、2、4、10、20、40、100 μg/ml）貯備液50 μl、內標貯備液30 μl，配制成血漿質量濃度為0.5、1、2、5、10、20、50 μg/ ml的生物樣品。按“2.1.5”項下方法處理生物樣品，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以VG質量濃度（x，μg/ ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得股靜脈、肝門靜脈樣本回歸方程均為y=0.160 5x+0.001 9（r=0.999

6），VG質量濃度線性范圍為0.5～50 μg/ml；胃、腸部位樣本回歸方程均為y=0.168 8x－0.035 1（r=0.999 7），VG質量濃度線性范圍為0.2～20 μg/ml。

2.4 檢測限（LOD）和定量限（LOQ）試驗

將已知質量濃度的對照品貯備液無限稀釋，精密吸取50 μl至100 μl的空白血漿中，按“2.1.5”項下方法處理樣品，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，結果，VG的檢測限（信噪比為3）為0.18 μg/ml、定量限（信噪比為10）為0.06 μg/ml。

2.5 精密度試驗

取低、中、高質量濃度QC樣品，各6份，連續(xù)測定3 d，以當日的標準曲線計算QC樣品的濃度，考察方法精密度。結果，日內精密度RSD在6.77%～9.04%之間（n=6），日間精密度RSD在2.90%～6.66%之間（n=6）。

2.6 提取回收率試驗

取100 μl空白血漿18份，除不加系列對照品溶液和內標貯備液外，按“2.1.5”項下方法操作，吸取上清液后加入系列對照品溶液50 μl和內標貯備液30 μl，渦旋混合，50 ℃氮氣流下吹干。殘留物以100 μl流動相溶解，按“2.1.3”項下方法離心10 min，取上清液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。設定該處理方法得到數(shù)據(jù)的提取回收率為100%。另取低、中、高質量濃度的QC樣本，各5份，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并與上述設定的提取回收率進行比較。結果顯示，VG的提取回收率為89.2%～99.0%，RSD均小于15%（n=5）。

2.7 VG在大鼠體內的首關效應研究

2.7.1 VG在肝臟的代謝率 10只SD大鼠隨機分為肝門靜脈給藥組和股靜脈給藥組，每組5只。各組大鼠ip 20%烏拉坦0.3 ml/kg。待大鼠輕微麻醉后，將其固定在手術臺上，行頸動脈插管術，管內充滿含80 u/ml肝素的生理鹽水以防止血液凝固。肝門靜脈給藥組大鼠插管后立即剖開腹腔，開口約2 cm，找到腸系膜上靜脈，通過腸系膜上靜脈iv VG 10 mg/kg，給藥時間為5 min。隨后立即行腹腔縫合手術，并在給藥后0、3、5、10、15、20、30、50、80、120、180、240、330 min于頸動脈采血適量。按“2.1.3”項下方法離心15 min，收集血漿，于－20 ℃冰箱中保存，待測。在整個實驗過程中，大鼠始終于紅外燈照射下維持正常體溫，以確保實驗的正常進行。在進行肝門靜脈給藥的同時，設計平行實驗以減少實驗誤差，故同時在股靜脈iv等體積生理鹽水。股靜脈給藥組大鼠行動脈插管后，將大鼠一側腿部皮膚打開，找到股靜脈后灌注VG 10 mg/kg，給藥時間5 min，隨后立即縫合，采血時間和平行實驗設計同肝門靜脈給藥組大鼠。通過測定VG在肝臟的AUC和生物利用度（%），計算代謝率（%）=1－生物利用度。

各組大鼠于給藥后5 min出現(xiàn)了血漿藥物濃度的最高峰；于給藥后20 min出現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象。VG在肝臟的血藥濃度-時間曲線見圖2，藥動學參數(shù)見表1。

結果，肝門靜脈給藥后，VG在血漿中的生物利用度為45.1%，即肝臟對VG的代謝率為54.9%。

2.7.2 VG在胃、腸道的代謝率 15只SD大鼠隨機分為胃灌注組、腸灌注組和肝門靜脈給藥組，每組5只，麻醉及插管方法同“2.7.1”項下方法。胃灌注組大鼠插管后剖開腹腔，開口約為2 cm，找到胃后從胃底部灌注VG 20 mg/kg，灌注時間為5 min，隨后行腹部縫合術；腸灌注組大鼠插管后剖開腹腔，開口約為2 cm，找到十二指腸后從距離幽門端1 cm的位置灌注VG 20 mg/kg，灌注時間為5 min，隨后行腹部縫合術；肝靜脈給藥組大鼠處理方法同“2.7.1”項下方法。各組采血時間和平行實驗設計同“2.7.1”項下方法。測定VG在胃、腸道的AUC和生物利用度，計算代謝率。

圖2 VG在肝臟的血藥濃度-時間曲線Fig 2 Blood-time curve of VG concentration in liver

表1 VG在肝臟的藥動學參數(shù)Tab 1 Pharmacokinetic parameters of VG in liver

VG在胃、腸道的血藥濃度-時間曲線見圖3，藥動學參數(shù)見表2。

圖3 VG在胃、腸道的血藥濃度-時間曲線Fig 3 Blood-time curve of VG concentration in stomach and intestine

表2 VG在胃、腸道的藥動學參數(shù)Tab 2 Pharmacokinetic parameters of VG in the stomach and intestine

結果，與肝門靜脈灌注組比較，胃、腸道灌注組大鼠的生物利用度分別為98.3%、8.1%，代謝率分別為1.7%、91.9%。

2.7.3 CYP 3A與P-gp對VG腸吸收的影響 15只SD大鼠隨機分為腸灌注組、股靜脈給藥組和生理鹽水組，每組5只。腸灌注組和生理鹽水組大鼠于腸灌注VG前10 min先分別灌注鹽酸維拉帕米注射液（60 ml/kg）與等體積生理鹽水后，按“2.7.2”項下方法處理；股靜脈給藥組大鼠于灌注VG前10 min先灌注鹽酸維拉帕米注射液（60 ml/kg）后，按“2.7.1”項下方法處理。各組采血時間和平行實驗設計同“2.7.1”項下方法。考察維拉帕米對VG藥動學的影響。

各組大鼠加用鹽酸維拉帕米后VG的血藥濃度-時間曲線見圖4。

圖4 各組大鼠灌注鹽酸維拉帕米后VG的血藥濃度-時間曲線Fig 4 Blood-time curves of VG of the groups after infusionof verapamil

結合圖2與圖4可知，維拉帕米對股靜脈給藥組大鼠的VG藥動學幾乎不產生影響；與生理鹽水組比較，腸灌注組大鼠VG的AUC表現(xiàn)出輕微的增加趨勢，同時雙峰現(xiàn)象的程度有所增加。

3 討論

本研究探討VG在大鼠肝門靜脈、十二指腸以及胃中的代謝率，其給藥劑量依據(jù)預實驗得出，即大鼠肝門靜脈給藥劑量為10 mg/kg、十二指腸為20 mg/kg、胃為20 mg/kg。為研究腸道內CYP3A與P-gp對VG腸吸收的影響，根據(jù)動物與人臨床用藥換算原則，在VG給藥前先給予鹽酸維拉帕米注射液60 mg/kg。

本研究結果顯示，肝臟、腸道、胃對VG的代謝率分別為54.9%、91.9%、1.7%，即肝首關作用和腸首關作用是導致VG生物利用度低的主要原因。另一方面，與生理鹽水組比較，腸灌注組大鼠體內VG的AUC表現(xiàn)出輕微的增加趨勢，同時雙峰現(xiàn)象的程度有所增加，說明在一定程度上維拉帕米對VG起到了競爭性抑制的作用，據(jù)此初步判斷VG是腸道CYP3A和/ 或P-pg的底物。因此，在臨床應用中，可以考慮通過聯(lián)合用藥的方法增加VG的吸收率，以解決其口服生物利用度低的問題。

此外，本研究建立的HPLC法具有專屬性，經證實可用于大鼠血漿中VG含量的測定。綜上所述，肝首關作用和腸首關作用是導致VG生物利用度低的主要因素，初步判斷VG是腸道CYP 3A和/或P-gp的底物。本研究結果可為后續(xù)新藥劑型的開發(fā)與利用提供一定的參考。

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Study on the First-Pass Effects of Vitexin-4′-O-Glucoside in Rats in vivo

WU Chengju1，CHAI Jiyan1，ZHANG Wenjie2（1.Teaching and Experiment Center，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；2.College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning Dalian 116011，China）

OBJECTIVE：To investigate the first-pass effect and mechanism of vitexin-4′-O-glucoside（VG）in rats so as to provide a basis for new drug development.METHODS：10 SD rats were divided into a group of hepatic portal venous administration and a group of femoral venous administration，which respectively received VG iv at superior mesenteric vein and femoral vein，and then metabolic rate was calculated by finding out the AUC of VG in the rats’livers.15 SD rats were divided into a group of gastric infusion，a group of intestinal infusion and a group of hepatic portal venous infusion，which respectively received VG by infusion at gastric fundus and duodenum and iv at superior mesenteric vein，and then metabolic rate was calculated by finding out the AUC of VG in the rats’stomachs and intestines.15 SD rats were divided into a group of intestinal infusion，a group of femoral venous administration and a group of normal saline.At 10 min before administration，the former two groups were given by infusion verapamil injection（60 ml/kg），the substrate of CYP3A and P-glycoprotein（P-gp）；and the group of normal saline were given by infusion of isometric normal saline，and then the rats were given VG as above to observe the effect of verapamil on intestinal absorption of VG.RESULTS：The metabolic rates of VG in the liver，stomach and intestine were 54.9%，1.7%and 91.9%respectively.After infusion of verapamil，slight increase in AUC of VG was found in the rats in the group of intestinal infusion.CONCLUSIONS：The first-pass effects in the liver and intestine are the main factors related to the low bioavailability of VG.Based on preliminary judgment，VG is the substrate of intestinal CYP3A and/or P-gp.

Vitexin-4′-O-glucoside；The first-pass effect；Metabolic rate；CYP3A；P-glycoprotein；Rats

R969.1

A

1001-0408（2016）25-3491-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.11

2016-04-08

2016-07-18）（編輯：劉明偉）

沈陽市科技計劃項目（No.F13-194-9-00）

＊高級實驗師。研究方向：生理藥理與實驗針灸。電話：024-31207016。E-mail：1935116200@qq.com