調經助孕膠囊對著床障礙模型小鼠子宮內膜容受性的影響及其機制研究Δ

王瑞杰（河南中醫藥大學第二臨床醫學院，鄭州 450002）

調經助孕膠囊對著床障礙模型小鼠子宮內膜容受性的影響及其機制研究Δ

王瑞杰＊（河南中醫藥大學第二臨床醫學院，鄭州 450002）

目的：研究調經助孕膠囊對著床障礙模型小鼠子宮內膜容受性的影響及其機制。方法：將妊娠小鼠隨機分為正常組、模型組和調經助孕膠囊低、高劑量組［12、24 g/（kg·d）］，每組10只。從妊娠第1天開始，各給藥組小鼠ig相應藥物，正常組和模型組小鼠ig生理鹽水，連續3 d；妊娠第4天，除正常組外，其余各組小鼠均ih米非司酮溶液復制著床障礙模型；妊娠第5天處死小鼠。觀察子宮內膜組織形態變化，并對子宮內膜成熟度進行評分；檢測子宮內膜白血病抑制因子（LIF）、同源框基因HOXA10、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質金屬蛋白酶抑制因子1（TIMP-1）蛋白表達水平。結果：與正常組比較，模型組和各給藥組小鼠子宮內膜發育均不完全，成熟度評分和子宮內膜LIF、HOXA10、MMP-9、TIMP-1蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，給藥組小鼠子宮內膜發育得到改善或趨向正常，各指標水平均明顯升高（P＜0.05）；且調經助孕膠囊高劑量組指標改善較低劑量組更明顯（P＜0.05）。結論：調經助孕膠囊可改善著床障礙小鼠的子宮內膜容受性；其機制可能與上調HOXA10、LIF基因的表達，維持MMP-9、TIMP-1平衡有關。

調經助孕膠囊；著床障礙；子宮內膜容受性；成熟度評分；機制；小鼠

在體外受精-胚胎移植過程中，胚胎順利著床是決定受精是否成功的關鍵。子宮內膜容受性指子宮內膜對胚胎的接受能力，受到多種因素的影響。在女性正常月經周期，卵巢雌、孕激素共同作用于子宮內膜，促進腺體、間質發育成熟，而子宮內膜與胚胎、卵泡發育的同步性是確保受精卵著床的前提條件。子宮內膜與胚泡發育同步，可提高子宮內膜容受性，促進胚胎著床。胚泡植入子宮內膜的過程涉及一系列細胞、分子信號的傳遞，同源框基因HOXA10和白血病抑制因子（LIF）則被認為是影響胚胎植入的關鍵調控因子。其中LIF可促進胚泡與子宮內膜黏附，調控母胎免疫耐受，促進子宮內膜成熟；HOXA10蛋白則為胚胎著床必需蛋白，是影響子宮內膜容受性的關鍵因素。研究顯示，基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質金屬蛋白酶抑制因子1（TIMP-1）的動態平衡同樣會對胚胎植入、子宮內膜容受性產生影響［1］。其中MMP-9與月經發生、子宮內膜重建、排卵、胚胎植入有密切關聯；TIMP-1則可促進子宮內膜修復與生長，抑制MMP-9侵襲滋養細胞。雖然藥物刺激超促排卵可提高體外受精的成功率，但同時也會導致激素平衡失調，影響卵泡細胞質量，降低子宮內膜容受性，從而導致受精率、妊娠率降低［2］；且較多促排卵化學藥均對性激素分泌、卵子發育有不同程度的負面影響，會干擾子宮內膜正常發育，從而降低子宮內膜容受性及體外受精成功率［3］。

調經助孕膠囊是在中醫婦科專家褚玉霞教授（原河南中醫學院婦科教研室主任）的經驗方二紫贊育濃縮丸/二紫膠囊基礎上研制而成，由紫石英、紫河車、菟絲子、仙靈脾、香附、砂仁、丹參、熟地黃、川牛膝等11味藥材組成，具有滋腎補腎、理氣活血、調經助孕之效。近年來其被證實可提高無排卵性不孕癥患者的血清雌、孕激素水平，調節內分泌，促進卵泡發育，提高排卵率及妊娠率［4］，但其相關作用機制還尚未明確。基于此，本研究擬通過建立著床障礙小鼠模型，并給予調經助孕膠囊，旨在明確調經助孕膠囊對著床障礙小鼠子宮內膜容受性的影響及其相關的作用機制，為其臨床應用提供一定的基礎實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

CX23光學顯微鏡（日本Olympus公司）；Heraeus Biofue Primo R臺式低溫高速離心機（德國Siemens公司）；Ventana-ES全自動免疫組化染色儀（美國Ventana公司）；Q500MC圖像分析軟件（德國Leica公司）。

1.2 藥品與試劑

調經助孕膠囊（河南省中醫學院第二附屬醫院制劑室自制，批號：002320，規格：每1 g膠囊含生藥1.5 g）；米非司酮片（北京紫竹藥業有限公司，批號：020710，規格：25 mg/片）；兔抗鼠LIF、HOXA10多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號：NBP1-85717、BA0918）；兔抗鼠免疫球蛋白G（IgG）、MMP-9、TIMP-1多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號：I0700-7、2844710、9G101）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

正常性成熟昆明種小鼠，♀（80只，未交配）、♂（40只），鼠齡5～6周，體質量18～22 g，均由河南省動物實驗中心提供［許可證號：SCXK（豫）2011-001］。將小鼠置于室溫為23 ℃、明暗時間比為12 h∶12 h、濕度為80%的環境下，適應性飼養7 d后用于實驗，期間自由攝食、飲水。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

1) 上述M，L，動態仿真觀察周期TV，腹地貨物產生周期T0，α,β,H,λ,ω,Pi,pi,DGT,IDGT,1,IDGT,2,Ts等賦值，并給定初始值T=0，j=0。

將♀、♂小鼠分籠飼養3 d，每天下午17：00將小鼠（♀、♂比例為2∶1）合籠，次日上午8：00檢查♀小鼠陰道后分籠，發現陰栓則標記為妊娠第1天。將妊娠小鼠按隨機數字表法分為正常組、模型組和調經助孕膠囊低、高劑量組［12、24 g/（kg· d），根據體表面積法換算分別為人臨床用量的10、20倍］，每組10只。妊娠第1天，各給藥組小鼠ig相應藥物，正常組和模型組小鼠ig生理鹽水，連續3 d；妊娠第4天，除正常組外，其余各組小鼠均于上午9：00 ih米非司酮溶液（0.08 mg/只）復制著床障礙模型［5］。觀察小鼠的精神狀態、飲食等一般情況，并在光鏡下觀察陰道分泌物，若見分泌物明顯增多且見大量核角化細胞則表明建模成功。

2.2 子宮內膜成熟度考察

妊娠第5天，各組小鼠尾iv滂胺天藍溶液0.2 ml，觀察10 min，小鼠眼球及口周見藍色后處死。開腹，取子宮（有藍染點子宮則取藍染點處，無藍染點則取對應部位），置于4%甲醛中固定20 h。常規制備切片后，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察子宮內膜組織形態變化。參照文獻［6］中方法對小鼠子宮內膜腺體發育、間質形態等進行評分，評價子宮內膜成熟度，評分總分為9分。若得分為8～9分則表示子宮內膜發育成熟；得分為6～7分表示子宮內膜發育延遲；若得分≤5分表示子宮內膜與卵泡發育不同步。

2.3 子宮內膜LIF、HOXA10、MMP-9、TIMP-1蛋白表達測定

采用免疫組化SP法。取小鼠子宮切片，脫蠟，滴50 μl 3%過氧化氫，37 ℃孵育20 min，熱抗原修復；PBS沖洗3次，滴兔抗鼠LIF、HOXA10、MMP-9、TIMP-1多克隆抗體，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次；再滴加兔抗鼠IgG抗體，室溫孵育0.5 h，PBS沖洗3次；顯色、貼片、脫水、透明、封片。光鏡下觀察，每組切片取5個高倍視野，陽性細胞定位于胞漿，為棕黃色顆粒。采用全自動圖像分析系統進行分析，LIF、HOXA10蛋白表達情況以光密度（OD）值進行判定（OD值越高，表示蛋白表達越強，下同）；MMP-9、TIMP-1蛋白表達情況以含棕黃色顆粒物質面積總和、積分光密度值及黑度均值進行判定。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 一般情況觀察結果

給藥期間，各組小鼠精神狀態均良好、活動敏捷、飲食正常、未見異常分泌物，眼、鼻、口腔均潔凈，無明顯異常反應。經觀察，本實驗用于造模的所有小鼠均造模成功。

3.2 各組小鼠子宮形態觀察結果

正常組小鼠子宮內膜發育正常，腺體數量較多且分布均勻，腺上皮為單層柱狀上皮，夾雜透亮細胞，少見頂漿分泌，腺腔增大，內可見分泌物；模型組小鼠子宮內膜發育差，腺體小，細胞呈梭形，間質致密，螺旋動脈較少，呈增生期改變，部分間質水腫、疏松，部分間質致密，間質發育不同步；調經助孕膠囊低劑量組小鼠子宮內膜發育較模型組有所改善，腺體增多、分布趨向均勻，間質疏松水腫，可見螺旋小動脈增生，接近功能層；調經助孕膠囊高劑量組小鼠子宮內膜發育趨向正常，腺體明顯增加、分布較均勻，腺腔增大，部分間質可見梭形細胞。各組小鼠子宮病理切片圖見圖1。

圖1 各組小鼠子宮病理切片圖（HE染色，×200）Fig 1 The uterine pathological pictures of mice in all groups （HE staining，×200）

3.3 各組小鼠子宮內膜成熟度評分結果

與正常組比較，模型組及調經助孕膠囊低、高劑量組小鼠子宮內膜成熟度評分降低（P＜0.05）；與模型組比較，調經助孕膠囊低、高劑量組小鼠子宮內膜成熟度評分升高（P＜0.05）；與調經助孕膠囊低劑量組比較，調經助孕膠囊高劑量組小鼠子宮內膜成熟度評分升高（P＜0.05）。各組小鼠子宮內膜成熟度評分結果見表1。

表1 各組小鼠子宮內膜成熟度評分結果（±s，n=10）Tab 1 The endometrial maturity scores of mice in all groups （±s，n=10）

表1 各組小鼠子宮內膜成熟度評分結果（±s，n=10）Tab 1 The endometrial maturity scores of mice in all groups （±s，n=10）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與調經助孕膠囊低劑量組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.group of low-dose Tiaojingzhuyun capsules，ΔP＜0.05

子宮內膜成熟度評分8.66±0.28 4.56±0.97＊7.22±0.26＊#7.91±0.11＊#Δ組別正常組模型組調經助孕膠囊低劑量組調經助孕膠囊高劑量組劑量，g/（kg·d）12 24

3.4 各組小鼠子宮內膜LIF、HOXA10、MMP-9、TIMP-1蛋白表達測定結果

與正常組比較，模型組和調經助孕膠囊低、高劑量組小鼠子宮內膜LIF、HOXA10、MMP-9、TIMP-1蛋白表達均減弱（P＜0.05）；與模型組比較，調經助孕膠囊低、高劑量組小鼠子宮內膜LIF、HOXA10、MMP-9、TIMP-1蛋白表達均增強（P＜0.05）；與調經助孕膠囊低劑量組比較，調經助孕膠囊高劑量組小鼠子宮內膜LIF、HOXA10、MMP-9、TIMP-1蛋白表達均增強（P＜0.05）。各組小鼠子宮內膜LIF、HOXA10、MMP-9、TIMP-1蛋白表達測定結果見表2。

表2 各組小鼠子宮內膜LIF、HOXA10、MMP-9、TIMP-1蛋白表達測定結果（±s，n=10）Tab 2 The protein expression levels of LIF，HOXA10，MMP-9，TIMP-1in endometria of mice in all groups（±s，n=10）

表2 各組小鼠子宮內膜LIF、HOXA10、MMP-9、TIMP-1蛋白表達測定結果（±s，n=10）Tab 2 The protein expression levels of LIF，HOXA10，MMP-9，TIMP-1in endometria of mice in all groups（±s，n=10）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與調經助孕膠囊低劑量組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.group of low-dose Tiaojingzhuyun capsules，ΔP＜0.05

組別正常組模型組調經助孕膠囊低劑量組調經助孕膠囊高劑量組MMP-9 TIMP-1劑量，g/（kg·d）LIF（OD值）0.41±0.06 0.17±0.01＊0.32±0.07＊#0.39±0.05＊#ΔHOXA10（OD值）140.26±8.06 101.52±4.35＊121.26±7.64＊#132.21±6.32＊#Δ黑度均值107.32±1.62 97.48±1.22＊101.74±1.98＊#105.93±1.22＊#Δ12 24面積總和，μm2178 628.26±11 432.33 96 697.52±22 635.15＊128 765.21±15 494.58＊#163 438.85±13 155.28＊#Δ積分光密度58 543.19±1 532.25 29 996.54±2 866.15＊47 612.43±2 810.55＊#53 114.26±1 844.39＊#Δ黑度均值103.76±1.84 86.12±2.67＊92.36±2.22＊#98.24±1.89＊#Δ面積總和，μm2169 284.52±6 682.56 101 378.98±22 936.35＊126 754.42±18 944.52＊#156 124.08±14 119.16＊#Δ積分光密度54 397.58±1 452.66 31 168.74±3 602.25＊45 851.58±2 542.44＊#51 479.08±2 543.05＊#Δ

4 討論

近年來，我國不孕癥發病率呈逐漸上升趨勢［7］。降低不孕癥患病率、提高妊娠率已成為生殖醫學領域研究的重點課題。輔助生殖技術（ART）是臨床治療不孕癥的主要手段，其中體外受精-胚胎移植為ART中最為成熟的技術。目前體外受精成功率已突破70%，但臨床妊娠率僅為40%［8］。胚胎著床障礙是導致受精率高、妊娠率低的主要原因。胚胎著床過程較復雜，其成功率與子宮內膜容受性有緊密聯系。正常條件下，為確保胚胎在子宮內膜種植，多選擇子宮內膜對胚胎接受能力最強的種植窗期［9］。以米非司酮建立穩定性著床障礙小鼠模型的方法已被認可。一般妊娠4 d，小鼠發育正常胚胎已轉移至子宮腔，此時給予米非司酮可通過影響輸卵管運動及胚泡發育，阻止胚胎著床前子宮內膜由增生期向分泌期變化，降低子宮內膜容受性，引起著床障礙；且米非司酮給藥起效速度快，一般6～30 h即可見效，同時對其他系統無副作用，造模安全、簡便［10］。故在本文中采用此種方法復制著床障礙小鼠模型。

臨床研究已證實，以LIF、HOXA10、整合素β3等為主的多類調控因子會影響胚胎著床［11］。LIF為白細胞介素6家族成員，本質為糖蛋白，可誘導肝細胞發生急相反應、促進骨髓白血病細胞分化、控制胚胎肝細胞分化等，其參與了胚胎著床、分化、發育以及子宮內膜容受性調節等過程［12］。子宮內膜中LIF經腔上皮、腺上皮細胞分泌后進入宮腔，作用于子宮內膜上皮，提高子宮內膜對胚胎的容受性，調控母胎免疫；同時LIF可通過調節胚胎植入能力以及植入深度來確保妊娠成功。HOX則為同源框基因，在胚胎形成過程中有重要作用。子宮內膜經歷有序過程后形成胚胎容受狀態，HOX基因則可介導胚胎形成、生長發育，促進子宮內膜容受狀態的形成。HOXA10基因為HOX基因中的一種，其主要表達于子宮內，與子宮發育及子宮內膜容受性聯系密切，可調控多種靶基因，影響胚胎著床。HOXA10基因可與下游轉錄調控區結合，誘導靶基因轉錄，促進整合素β3、環氧合酶2、前列腺E2受體的釋放，參與子宮內膜細胞增殖、胚胎著床［13］。

MMPs為依賴于鋅離子、鈣離子的蛋白水解酶家族中的一員，參與細胞外基質（ECM）的重塑與降解。研究發現，子宮內膜所分泌的MMPs與內膜重建、胚胎植入等有關［14］。TIMPs則為MMPs抑制因子，兩者在體內同步表達，并結合形成復活體，從而抑制MMPs活性。TIMPs不僅可調節ECM降解，同時可參與其更新與重塑，對子宮內膜修復及生長有其較好的輔助作用。MMP-9則為子宮內膜所分泌的MMPs酶中主要的蛋白水解酶；TIMP-1為MMP-9關鍵抑制因子，其可與活化的MMP-9結合成復合體，從而抑制MMP-9活性。MMP-9、TIMP-1表達失衡也是造成不孕不育的重要原因［15］。

中醫學認為，腎虛是著床障礙不孕癥的病因，在治療方面需重視調理腎臟、兼顧肝脾。調經助孕膠囊為中醫婦科專家河南省中醫院褚玉霞教授的經驗方，為純中藥制劑，方中紫石英散寒暖宮、溫陽補腎、填精益髓；紫河車益精血、補肝腎；菟絲子滋陰補陽；仙靈脾壯陽益精；丹參活血通絡；香附疏肝解郁、通氣降逆；熟地黃滋陰補血；砂仁理氣安胎、溫脾止瀉；川牛膝逐瘀通經。方中諸藥共用可同奏理氣活血、滋陰補腎、調經助孕之效。本研究結果顯示，模型組小鼠的子宮內膜成熟度評分低于5分，表明該組小鼠子宮內膜與卵泡發育不同步，子宮內膜容受性較差；給予調經助孕膠囊后成熟度評分升高，子宮內膜形態接近正常，提示子宮內膜的容受性得到改善；且給藥后小鼠子宮內膜LIF、HOXA10、TIMP-1、MMP-9表達均明顯上調，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

綜上，調經助孕膠囊可顯著改善著床障礙小鼠子宮內膜容受性，其機制可能與上調子宮內膜容受指標LIF、HOXA10基因的表達，維持TIMP-1、MMP-9平衡有關。

［1］韓霞.補腎安胎中藥對著床障礙小鼠子宮VEGF和MMP-9 mRNA表達的影響［J］.陜西中醫，2013，34（4）：497.

［2］閆文杰，楊菁，尹太郎，等.中藥助孕方對促排卵和胚泡著床障礙小鼠子宮內膜容受性的影響［J］.中國中西醫結合雜志，2012，32（11）：1 554.

［3］余楠，楊菁，徐望明，等.助孕方對著床障礙模型小鼠胞飲突及白血病抑制因子表達的影響［J］.中華臨床醫師雜志：電子版，2013，7（11）：4 873.

［4］李小妮，李雅璇，周吉海，等.補腎助孕湯對小鼠生殖能力影響的實驗研究［J］.中國中西醫結合雜志，2013，33（3）：365.

［5］田瀅舟，朱靜妍，朱秀君，等.腎虛胚胎著床障礙小鼠病證結合模型的建立與評價［J］.中國現代醫學雜志，2014，24 （11）：14.

［6］楊淼，黃曉武，閔樂泉，等.基于形態學重構的宮腔鏡下子宮內膜腺體開口標記算法［J］.北京生物醫學工程，2015，34（5）：468.

［7］Blitek A，Kaczmarek MM，Kiewisz J，et al.Endometrial and conceptus expression of HoxA10，transforming growth factor β1，leukemia inhibitory factor，and prostaglandin H synthase-2 in early pregnant pigs with gonadotropininduced estrus［J］.Domest Anim Endocrin，2010，38（4）：222.

［8］朱秀君，朱靜妍，徐珉，等.益腎填精助孕法對腎虛胚胎著床障礙小鼠子宮內膜表面胞飲突表達的影響［J］.中醫藥導報，2013，19（7）：4.

［9］鐘婷，宗滕，賴麗丹，等.不同胚泡移植的液體量對小鼠胚胎分布和妊娠的影響及其作用機制［J］.廣東醫學，2014，35（1）：43.

［10］白玉濤，張玉玲，代娟，等.ICR小鼠著床障礙模型的建立［J］.東北農業大學學報，2012，43（3）：63.

［11］葉虹，黃國寧，曹云霞，等.尿源性高純度FSH在控制性促排卵中對IVF-ET結局的影響［J］.中華婦產科雜志，2013，48（11）：838.

［12］ Sun X，Bartos A，Whitsett JA，et al.Uterine deletion of Gp130 or Stat3 shows implantation failure with increased estrogenic responses［J］.Mol Endocrinol，2013，27（9）：1 492.

［13］邱卓琳，李紅，毛向明，等.不同劑量促排卵激素對昆明小鼠卵子及胚胎發育潛能的影響［J］.廣東醫學，2012，33 （3）：325.

［14］ Dunlap KA，Filant J，Hayashi K，et al.Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice［J］.Biol Reprod，2011，85 （2）：386.

［15］孟艷岑，張明敏，崔丹丹，等.補腎、活血對超促排卵小鼠著床期間子宮內膜MMP-2、MMP-9、TIMP-3表達的影響［J］.華中科技大學學報：醫學版，2013，42（6）：627.

Study on the Effects of Tiaojingzhuyun Capsules on Endometrial Receptivity in Mice with Implantation Dysfunction and Its Mechanism

WANG Ruijie（Second Clinical Medical College，Henan University of TCM，Zhengzhou 450002，China）

OBJECTIVE：To investigate the effects of Tiaojingzhuyun capsules on endometrial receptivity in mice with implantation dysfunction and corresponding mechanism.METHODS：Pregnant mice were randomized into normal group，model group and the groups of low and high-dose［12，24 g/（kg·d）］Tiaojingzhuyun capsules，with 10 mice in each group.The mice in the drug administration groups were given corresponding drugs intragastrically，while those in the normal group and the model group were given normal saline intragastrically，for 3 consecutive days from the 1st day of pregnancy.On the 4th day of pregnancy，the mice in all groups except for the normal group were given mifepristone solution subactaneously to establish model of implantation dysfunction.On the 5th day of pregnancy，the mice were sacrificed，and then the change in endometrial morphology was observed and endometrial maturity was scored；the protein expression levels of leukaemia inhibitory factor（LIF），homoeobox gene HOXA10，matrix metalloproteinase 9（MMP-9）and matrix metalloproteinase inhibitory factor 1（TIMP-1）expression in endometrial tissues were determined.RESULTS：Compared to the normal group，the mice in the model group and the drug administration groups had endometrial hypoplasia and obviously lower endometrial maturity score and protein expression levels of LIF，HOXA10，MMP-9 and TIMP-1 in endometrial tissues（P＜0.05）.Compared to the model group，the mice in the drug administration groups demonstrated endometrial development which improved or tended to be normal and had significantly higher indexes mentioned above（P＜0.05）；besides，the effect shown in the group of high-dose Tiaojingzhuyun capsules was stronger than that in the group of low-dose Tiaojingzhuyun capsules（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Tiaojingzhuyun capsules can improve the endometrial receptivity in mice with implantation dysfunction by a mechanism which may be related to upregulating the gene expression of HOXA10 and LIF，and maintaining the balance of MMP-9 and TIMP-1.

Tiaojingzhuyun capsules；Implantation dysfunction；Endometrial receptivity；Maturity score；Mechanism；Mice

R285

A

1001-0408（2016）25-3484-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.09

2016-01-30

2016-07-08）（編輯：林 靜）

河南省教育廳科學技術研究重點項目（No.13A360579）；河南中醫學院博士啟動基金（No.BSJJ2012-21）；全國名老中醫藥專家傳承工作室建設項目（No.〔2014〕-20號）

＊講師，博士。研究方向：生殖內分泌、不孕不育。電話：0371-60908726。E-mail：wangruijie021@163.com