中重度膿毒癥長期生存大鼠模型的建立

焦裕霞，熊君宇*

(大連醫科大學附屬第二醫院麻醉科，遼寧 大連 116027)

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中重度膿毒癥長期生存大鼠模型的建立

焦裕霞，熊君宇*

(大連醫科大學附屬第二醫院麻醉科，遼寧 大連 116027)

目的 建立中重度膿毒癥長期生存大鼠模型，觀察膿毒癥自然轉歸的過程，為研究膿毒癥提供新思路和方法。 方法 將40只SD大鼠分為對照組(sham組，8只)與盲腸結扎穿孔術組(cecal ligation and puncture，CLP組，32只)，所有操作均在小動物麻醉機，七氟烷吸入麻醉下完成。所有大鼠在其右頸部建立動靜脈通路。術后恢復24 h后，CLP組大鼠通過盲腸結扎穿孔術致膿毒癥。手術完畢后將大鼠轉移到恢復室(室內溫度22～25℃)，單籠飼養。術后靜脈補液按1∶1比例分別給予6%HEAS和5%葡萄糖注射液，第1、2天補液量為20 mL/kg/12 h，之后液體減半直至大鼠開始飲食。根據大鼠生存情況CLP組大鼠自然分為生存組(survival組)和死亡組(dead組)。觀察術后大鼠至30 d，記錄大鼠的癥狀表現、體重變化、IL-10血漿濃度的變化，并解剖觀察腹腔內臟器改變。結果(1)CLP組術后24 h內生存率為75%，72 h內生存率為62.5%，7 d內生存率為50%。(2)根據膿毒癥嚴重程度評估系統，32只CLP組大鼠在術后24 h均達到中重度膿毒癥程度。(3)手術后，survival組與sham組體重均有下降。survival組大鼠從第4天開始體重下降明顯(P=0.017)。survival組大鼠在術后第6天體重下降至最低，較原體重下降(8.51±2.23)%；sham組則在術后第4天體重最低，較原體重下降(2.73±1.82)%，兩組差異具有統計學意義(P=0.026)。兩組大鼠在術后第30天時，體重的最大升高率(sham組(16.16±2.39)% 與survival組(13.03±3.74)%比無明顯差異(P=0.29)。(4)術后1 d與術前(0 d)相比，三組IL-10血漿濃度均有升高，survival組(P=0.000)和dead組升高明顯(P=0.010)。(5)腹部解剖見：dead組大量惡臭血性腹水，結扎腸管紫黑，無包裹，無粘連。survival組腹腔廣泛粘連，大網膜失去原有形態及光澤，趨向結扎腸管，但無膿腫包裹。sham組解剖未見異常。survival組大鼠脾臟占體重的(2.64±0.37)‰，sham組大鼠脾臟占體重的比例為(1.63±0.20)‰，兩者差異具有統計學意義(P=0.032)。 結論本實驗為建立CLP中重度膿毒癥長期生存者模型提供可靠的控制CLP的措施和篩選模型的方法，使其基本符合膿毒癥的發生發展規律。

膿毒癥；長期生存；大鼠模型

膿毒癥(sepsis)是機體因為對感染的反應損傷了自身組織，從而出現的一種威脅生命的狀態[1]。近40年來，盡管大量的基礎與臨床研究發現了膿毒癥期間許多有意義的變化，膿毒癥的發病機制仍未明確[2-4]。迄今為止也沒有特異性和敏感度高的生物指標可以明確診斷膿毒癥或判斷預后[5]。在膿毒癥治療方面，除支持治療外，還沒有國際公認的治療手段和藥物[6,7]。這使得我們不得不重新思考研究膿毒癥的思路和方法。膿毒癥的死亡率很高，但終究有生存者[8-10]。那么生存者為何生存，生存機制對膿毒癥治療有無意義。這些問題都有待于在研究膿毒癥生存者的實驗中解決。本實驗將介紹一種建立中重度膿毒癥長期生存大鼠模型的方法和篩選方法。

1　材料和方法

1.1實驗動物

清潔級雄性SD大鼠，8～9周齡，300～330 g，由大連醫科大學動物實驗中心提供[SCXK(遼)2013-0003]。所有實驗操作均按照該實驗中心的操作指南執行，并得到動物倫理委員會的許可。所有手術操作均在小動物麻醉機(Raymain，中國)下，吸入七氟醚(上海恒瑞，中國)麻醉下完成[SYXK(遼)2013-0006]。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組

手術前隨機分為兩組CLP組(n=32)和sham組(n=8)，CLP 術后隨膿毒癥的不同發展結果CLP組自然分為：CLP術后死亡組(dead組)和CLP術后生存至30 d組(survival組)。

1.2.2建立動靜脈通路

大鼠頸部備皮消毒，在胸骨上方偏右0.5 cm，開1 cm縱向切口，提起皮膚向右外側尋找，即可看見暗紫色充盈的右頸外靜脈，鈍性分離出來，利用用插管引導器(BD，美國)，置入PE-50導管(Smith Medical，英國，內徑0.58 mm，外徑0.96 mm，總長8 cm)1.5～2 cm結扎固定。注入約0.05 mL的150 U/mL的肝素鈉注射液封管(塞帽用22 G的實心鈍針頭剪成1 cm制成)。沿切口繼續分離開肌肉和筋膜，在左側胸鎖乳突肌外緣下方即可看見快速搏動的左頸動脈。用鑷子將其輕輕挑出，再鈍性分離開與其伴行的迷走神經，動作輕柔，勿損傷神經。用動脈夾于近心端夾閉動脈，置入PE導管，松開動脈夾，若置入成功即可見導管有動脈血涌入。同靜脈固定封管。將兩導管經頸后部皮下組織穿出，固定于大鼠兩耳中間稍后處，縫合切口。在PE導管貼上紅藍不干膠以區分動脈和靜脈導管。

1.2.3盲腸結扎穿孔(CLP)術

本實驗通過盲腸結扎穿孔(CLP)術致大鼠膿毒癥。建立靜脈通路的大鼠，待其恢復24 h后，進行手術。將大鼠腹部備皮消毒，臍上沿中線開腹1～2 cm，找到盲腸并暴露出來。CLP組用2-0絲線(強生，中國)結扎距盲端約2 cm。用21G三角針在結扎腸段交叉貫穿3次，并擠出腸內容物0.2 mL，約綠豆大小，將盲腸回納。sham組僅將盲腸暴露再回納。兩組大鼠均注入腹腔2 mL 0.9%氯化鈉注射液，輕輕搖晃腹腔，使腸管自然擺列。沖洗切口并關腹。用0.125%的布比卡因注射液局部浸潤切口部位作為術后鎮痛。

1.2.4術后護理與觀察

手術完畢后將大鼠轉移到恢復室(室內溫度22 ～25℃)，單籠飼養。放入已知量的鼠糧和水，每天更換墊料，觀察傷口及排泄物，記錄體重變化和膿毒癥評分。體重變化率=(原體重﹣現體重)/原體重×100%。術后靜脈補液按1:1比例分別給予6%羥乙基淀粉溶液(北京費森尤斯卡比藥業，中國)和5%葡萄糖注射液，第1、2天補液量為20 mL/kg/12 h，之后液體減半直至大鼠開始飲食。本實驗觀察術后大鼠至30 d，處死解剖觀察腹腔內臟器改變。

1.2.5實驗室檢查

分別于手術前(0 d)，手術后1 d，7 d，14 d，22 d，30 d取血1 mL，1000 g離心15 min，保存于-20℃冰箱，待用。選用大鼠白介素10(IL-10)酶聯免疫試劑盒(CUSABIO，中國)，按照說明書檢測IL-10外周血血漿濃度。

1.3統計學方法

2　結果

2.1實驗大鼠的生存情況

sham組30 d生存率100%。CLP組術后1 d內生存率為75%，3 d內生存率為62.5%，7 d內生存率為50%，其生存曲線如圖1示。

圖1　CLP后大鼠30天生存曲線Fig.1　Survival rate of rats after CLP for 30 days

2.2術后24 h膿毒癥評估

根據膿毒癥嚴重程度評估系統(表1)[11]，對CLP組大鼠在術后24 h進行評估。每一大鼠需在外觀和警惕性的評估標準中，至少滿足兩個條件，方可屬于該等級。平均動脈壓檢測時，動脈波形需明顯并且至少平穩10 min中，方可記錄數值。16只CLP組大鼠在術后24 h均達到中重度膿毒癥程度。除表中描述的表現外，CLP組大鼠還有口鼻周圍見血漬，惡臭稀便，術后1～3 d無自主飲表現食的表現。

表1　膿毒癥嚴重程度評估表

2.3體重變化

每天記錄實驗大鼠的體重，比較sham組與survival組平均體重變化趨勢，如圖2所示。手術后，survival組與sham組體重均有下降。survival組大鼠從第4天開始體重下降明顯，至第12天均有統計學意義(P=0.017，0.001，0.001，0.003，0.017)；sham組大鼠體重雖有降低，與原體重相比無統計學意義。survival組大鼠在術后第6天體重下降至最低，較原體重下降(8.51±2.23)%；sham組則在術后第4天體重最低，較原體重下降(2.73±1.82)%。兩組大鼠的體重最大下降率相比較，具有統計學意義(P=0.026)。兩組大鼠在術后第30天時，均超越原體重，均有統計學意義，但兩組體重的最大升高率(sham組(16.16±2.39)% vs survival組(13.03±3.74)%)無明顯差異(P=0.29)，如圖3所示。

圖2　sham組與組體survival組體重隨時間的變化趨勢Fig.2　Changes in body weight in the survival and sham group

注：ΔP < 0.05，與手術前(0 d)比較。圖3　sham組與survival組體重變化率的比較Note.ΔP < 0.05, compared with preoperation (0 d).Fig.3　Compared with the maximum rates of loss and gain body weight

2.4實驗室結果

手術后1 d與術前(0 d)相比， 三組IL-10血漿濃度均有升高，sham組升高不明顯(P=0.122)，survival組(P=0.000)和dead組升高明顯(P=0.010)。如圖4所示。

注：ΔP < 0.05，與手術前(0 d)比較。圖4　三組大鼠IL-10血漿濃度在手術前后的組內比較。Note. ΔP < 0.05, compared with preoperation (0 d).Fig.4　Comparison of concentrations of IL-10 in three groups before and after surgery

2.5解剖

如圖5所示，dead組：對術后死亡30 min內大鼠解剖見大量惡臭血性腹水，結扎腸管紫黑，無包裹，無粘連。survival組：對30 d CLP組生存大鼠CO2麻醉處死后立即解剖見：腹腔廣泛粘連，大網膜失去原有形態及光澤，趨向結扎腸管，但無膿腫包裹。sham組：解剖未見異常。survival組大鼠脾臟增大明顯，占體重的(2.64±0.37)‰，sham組大鼠脾臟未見明顯變化，占體重的比例為(1.63±0.20)‰，兩者差異具有統計學意義(P=0.032)如圖6所示。

3　討論

Hotchkiss RS等[12]總結了膿毒癥可能的發生發展規律曲線，典型的膿毒癥早期死亡即歸因于促炎因子的瀑布式的級聯反應。然而，多數患者可以度過這一時期，進入炎癥后期，此時，若促炎反應與抗炎反應恢復平衡，患者即逐漸康復；若自然免疫和適應性免疫功能受損，患者則進入免疫抑制期，最終死于原發病惡化或二次感染。

注：A.腸管壞死；B.大網膜廣泛粘連；C.膿腫包裹。圖5　大鼠腹部解剖Nota.A.Necrosis of intestine; B.Adhesions of the greater; C.Encapsulated abscess.Fig.5　Abdominal anatomy of rat

注：ΔP < 0.05，與sham組比較。圖6　sham組與survival組脾/體重(‰)比較Note. ΔP < 0.05, compared with sham group.Fig.6　Compared with the spleen/body weight

正如前言所述，研究膿毒癥生存者模型，可以觀察到膿毒癥自然轉歸的過程。探討其規律和發生機制，不僅對揭露膿毒癥的發生發展機制，提供診斷治療依據有重要意義，而且還有利于研究膿毒癥的遠期預后，包括遠期生存率、患病率及生活質量等，是對膿毒癥更深一層的探索。本部分實驗建立中重度膿毒癥長期生存者模型的關鍵在于確保急性炎癥發生并持續(非一過性)的同時提高生存率，從癥狀表現，生理生化改變及解剖多方面篩選出符合要求的大鼠模型。

本部分實驗選擇通過盲腸結扎穿孔術致大鼠膿毒癥。Wichterman等[13]于1980年發明的盲腸結扎穿孔術(CLP)致大鼠膿毒癥模型是目前應用最廣泛的膿毒癥動物模型。CLP最大的優點是模擬闌尾炎穿孔致腹膜炎的病理過程，更接近臨床的發病過程。缺點在于難以準確控制感染程度，感染過重導致快速死亡，感染過輕則無法滿足實驗要求，有可能成為局部膿腫包裹模型[14，15]。影響CLP嚴重程度主要有三個主要因素，即結扎盲腸的長度，穿刺針的粗細和術后護理條件。因此本實驗采用統一的手術參數和術后護理條件保證其感染程度相似。我們經過反復試驗，發現以下方法可以控制急性炎癥嚴重程度，并且延續發展為腹膜炎，模擬膿毒癥的發病過程。①結扎盲腸的長度為2 cm既可以導致急性胃腸道生理功能紊亂，表現為大鼠術后一天就有明顯稀便，又可以緩慢自行恢復，有明確的發病過程和適當的生存率。②使用21G三角針經行穿刺可以避免穿孔過早閉合。③擠壓腸內容物的量相對較多，全部回納至腹腔，并且注入2 mL 0.9%氯化鈉注射液，并輕輕搖晃腹腔。這樣做即可以讓腸管自然排列，避免絞窄性腸梗阻，又可以將腸內容物彌散至全腹腔，導致急性彌散性腹膜炎，避免大網膜早期包裹。④為了提高該模型的生存率，我們對術后大鼠進行液體治療，這也是目前國際公認的唯一有效的治療膿毒癥的方法[6,7]。適當的膠體液可以有效擴充血容量，而葡萄糖注射液則可以提供因未進食缺失的能量[10]。⑤提高室溫至25℃左右，也有利于膿毒癥休克的恢復，提高生存率。

此外，本實驗采用七氟烷吸入麻醉，麻醉誘導及蘇醒迅速，對大鼠正常生理功能影響輕微。避免了腹腔注射麻醉藥易造成大鼠腹腔出血和腹腔腸管黏連，不利于腹部手術操作，且時間不易控制，蘇醒緩慢，術后死亡率高等缺點。建立動靜脈通路作為臨床麻醉常用的技術手段，能為監測和治膿毒癥療創造很多便利。本實驗將該技術應用于大鼠，并將留置導管從頸后皮下引出使得導管不易被大鼠掙脫，對大鼠創傷應激小，便于動脈采血和監測，使在大鼠無束縛清醒狀態下持續靜脈補液或泵藥成為可能。以上建立模型的方法，操作明確易行，重復性好。注：以上兩段詳細介紹操作要點，便于讀者重復實驗，建立模型，可反映模型的重復性。

模型的準確性，即可信性是確保實驗順利進行的基礎。多方面的、準確的篩選方法是必不可少的。到目前為止，還沒有公認的CLP膿毒癥模型建立成功的量化評估指標。本實驗通過癥狀表現，體重變化，相關細胞因子的增減以及解剖不同角度對模型嚴格篩選。大家常用的膿毒癥嚴重程度評估表，可以初步從模型外觀，警惕性及動脈血壓上判斷膿毒癥的嚴重程度，可能受觀察者主觀影響。本實驗發現CLP膿毒癥大鼠的體重在炎癥早期下降明顯，這可能由于CLP導致胃腸功能紊亂有關，可以反映CLP的嚴重程度。體重變化是量化指標，相對客觀，而且用體重的變化率進行比較還可以擯棄模型基礎值的影響。膿毒癥期間多種細胞因子發生變化，有促炎因子，也有抗炎因子，可以根據實驗目的選擇感興趣的分子檢測。檢測的方法也是多種多樣的，其中外周血中多種細胞因子，因為取材方便，多被選擇。而檢測方法也有包括酶聯免疫法，流式細胞學在內的多種簡單易操作的多種方法。本實驗用酶聯免疫法選擇檢測IL-10的血漿濃度，發現其在術后1 d發生明顯變化，說明早期炎癥劇烈發生。最后，對模型進行腹部解剖可以觀察有無腹膜炎，有無局部膿腫包裹，更加直觀，更加明確。此外，還可以觀察其他臟器的變化。本實驗著重觀察脾臟的改變，并發現膿毒癥30 d后脾臟明顯增大，具體機制尚未明確[16,17]，有待進一步研究，可能作為判斷膿毒癥嚴重程度的指標之一。注：該段說明了如何使得建立的模型具有可信性，需要上述多種方法進行驗證和篩選。

綜上所述，本實驗通過多種措施控制CLP的嚴重程度和不同的篩選方法，成功建立了符合膿毒癥發生發展規律的中重度膿毒癥30 d生存者模型。研究膿毒癥生存者模型為研究膿毒癥致病機制，治療方法，分期診斷，預后評估等提供新的研究思路和方式方法。

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Establishment of long term survival following sepsis: a rat model

JIAO Yu-xia，XIONG Jun-yu*

(Department of Anesthesiology, the Second Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116027, China)

Objective Establish a Long-term Survival Rat Model of Sepsis for recovery naturally, and the idea of researching about sepsis survivors may point out new research ideas and methods for sepsis. Methods40 SD rats were divided into the sham group (8) and the CLP group (32), with all surgical operations under the small animal anesthesia machine and sevoflurane inhalation anesthesia. PVC tubes were inserted into the right carotid artery and jugular vein, respectively. After a postoperative recovery of 24 hours, the rats in the CLP group received the cecal ligation and puncture (CLP), which caused sepsis. The rats were then transferred to the single cages in the recovery room (with the temperature kept between 22～25℃). After the surgery, we commenced fluid resuscitation, consisting of a solution 6% hetastarch and 5% Glucose in the ratio of 1:1. The amount was 20 mL/kg/12h on the first and second days after the surgery. Then it was halved until the rats started eating. These rats were observed about performance, weight and concentration of IL-10 until 30 days after the surgery, when they were anatomized and the change of their organs was watched. Results(1) The survival rate was 75% at 24 h, 62.5% at 72 h, 50% on 7 d after CLP in the CLP group. (2) Based on the severity of sepsis evaluation system, 32 rats at 24 h after CLP reached moderate to severe sepsis. (3) The body weight were decreased in both survival group and the sham group after CLP. The body weight of rats in survival group fell from the fourth day of survival was significantly (P=0.017), and to a minimum after the first six days, compared with the original weight loss (8.51±2.23)%. The body weight of rats in sham group fell to a minimum after the first four days, by which the lowest body weight loss (2.73±1.82)% than the original weight. The difference between two groups was statistically significant (P=0.026). After 30 days, the maximum weight increase rates[sham group (16.16±2.39)% vs survival group (13.03±3.74)%]were not different significantly (P=0.29). (4) Compared the preoperative (0 d) with postoperative 1d, all the plasma concentration of IL-10 in three groups was increased, which in survival group (P=0.000) and in dead group increased significantly (P=0.010). (5) Shown by abdominal anatomy, a large set of foetor and bloody ascites, black bowel, with no encapsulated abscess and adhesion in dead group; Abdominal adhesions, omental with losing shape and gloss and tending to ligation intestine, but no encapsulated abscess in survival group; no abnormal anatomy in sham group. The weight of spleen in total body weight ration was (2.64±0.37) ‰ in survival group and (1.63±0.20) ‰ in sham group. The difference between two group was statistically significant (P=0.032). ConclusionsThis experiment provided reliable measures of the CLP and methods of screening model, for the establishment of CLP in severe sepsis model of long-term survivors, which is basically in accordance with the occurrence and development of sepsis clinically.

Sepsis; Long-term survival; Rat medal

國家自然基金面上項目(81171791)。

焦裕霞(1981-)，女，主治醫師，博士研究生，專業：麻醉學。E-mail: jiaoyuxia@dmu.edm.cn。

熊君宇(1959-)，男，教授，主任醫師，博士生導師，研究方向：麻醉藥對膿毒癥機體的影響。E-mail：jyx0639@163.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016)09-0019-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.004

2016-04-05