糖尿病研究中的動(dòng)物模型進(jìn)展

宋丹，冉麗媛，姜如嬌，吳英杰,2,3*

(1.大連醫(yī)科大學(xué)重大疾病基因工程模式動(dòng)物研究所, 大連 遼寧　116044；2.大連醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院, 大連 遼寧　116044；3.大連醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，大連 遼寧　116044)

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糖尿病研究中的動(dòng)物模型進(jìn)展

宋丹1,3，冉麗媛1，姜如嬌1，吳英杰1,2,3*

(1.大連醫(yī)科大學(xué)重大疾病基因工程模式動(dòng)物研究所, 大連 遼寧116044；2.大連醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院, 大連 遼寧116044；3.大連醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，大連 遼寧116044)

雖然糖尿病的研究不斷有新的進(jìn)展，診斷方法和治療手段不斷更新，但其危害并沒(méi)有明顯降低，反而呈現(xiàn)逐年加重的趨勢(shì)。為了更深入、全面地揭示糖尿病機(jī)制，研發(fā)更有效、可靠、無(wú)低血糖風(fēng)險(xiǎn)的藥物必須清楚了解相應(yīng)的疾病模型。該文就糖尿病動(dòng)物模型的種類，建模方法，優(yōu)缺點(diǎn)，適用范圍等進(jìn)行綜合評(píng)述，旨在為研究者選擇合適的動(dòng)物模型提供參考。

糖尿病；動(dòng)物模型；基因工程

糖尿病是由于多種原因引起的代謝紊亂綜合征，常以慢性高血糖為主要特征。其發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)制尚未被充分了解，缺乏針對(duì)性強(qiáng)的有效治療手段。糖尿病動(dòng)物模型是研究糖尿病發(fā)病機(jī)制及新型治療藥物的關(guān)鍵，通過(guò)對(duì)建模過(guò)程中的動(dòng)物模型表觀現(xiàn)象的觀察及藥物作用于相應(yīng)動(dòng)物模型后的一系列反應(yīng)，可直接或者間接地認(rèn)識(shí)其病因、機(jī)制及新藥，所以，選擇適宜的糖尿病模型是研究的前提條件[1]。起初，世界衛(wèi)生組織(WHO)糖尿病專家委員會(huì)將糖尿病分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類。近年來(lái)，隨著對(duì)糖尿病認(rèn)識(shí)的逐步加深，對(duì)其遺傳易感基因及免疫學(xué)的深入研究，美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)(ADA)專家委員會(huì)對(duì)糖尿病的分類做了修改，新的分型為：1型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)、其他特殊類型糖尿病及妊娠糖尿病。用于糖尿病治療藥物篩選和治療機(jī)制研究的一般模型有動(dòng)物模型、細(xì)胞模型和分子水平模型。動(dòng)物模型又稱為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停迷谔悄虿∷幬锖Y選的最初及最后階段的藥物驗(yàn)證。細(xì)胞模型也稱為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停糜跈C(jī)理的探討和動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)的前期。動(dòng)物體內(nèi)基因修飾，即分子水平模型，又稱為基因?qū)嶒?yàn)?zāi)Ｐ停ㄟ^(guò)ZFN/TALEN/CRISPR等基因編輯技術(shù)將某個(gè)基因改變，從而研究該基因的作用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有明確的遺傳背景或者清晰的來(lái)源，是現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展的基本支撐條件之一(其他的三個(gè)要素為儀器設(shè)備、信息資料和化學(xué)試劑)，以其多方面的優(yōu)點(diǎn)而被研究者所喜愛(ài)和運(yùn)用：(1)與人類結(jié)構(gòu)、機(jī)能、代謝和疾病特點(diǎn)相似；(2)較人類慢性疾病發(fā)病過(guò)程短，節(jié)約時(shí)間；(3)按需要制作的疾病“復(fù)制版”更能控制和排除自然條件下不能排除的影響因素；(4)復(fù)制率高，可重復(fù)性好等等。

1　用于糖尿病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

糖尿病并不是由唯一病因引起的疾病，與遺傳、環(huán)境和自身免疫有關(guān)，其誘發(fā)因素較多，使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類也很廣泛，主要是哺乳動(dòng)物，如家兔，犬，豬，貓，猴等。犬具有較小的胰腺，適用于胰腺摘除。100多年前，Minkowski和Von Mehring二人切除狗的胰腺，成功建立了第一個(gè)1型糖尿病狗模型，之后的Morales AP等[2]用低劑量的鏈脲佐菌素來(lái)配合手術(shù)切除約90%胰腺，從而改進(jìn)了糖尿病模型的建立方法。糖尿病家兔模型主要用于糖尿病藥物實(shí)驗(yàn)研究中[3-5]。小型豬的生理學(xué)和解剖學(xué)特征包括代謝與人相似，具有多樣性的基因庫(kù)，其具有較短的繁殖周期，價(jià)格適中的優(yōu)點(diǎn)，是代謝性疾病如糖尿病，肥胖病等研究較為理想的動(dòng)物模型，國(guó)外利用小型豬已經(jīng)制作出了Sinclair 小型豬、Yucatan 小型豬、Yorkshire 小型豬等[6-9]糖尿病豬模型，國(guó)內(nèi)的小型豬模型主要分為三種品系：巴馬小型豬、五指山小型豬和中國(guó)農(nóng)大小型豬[10, 11]，前兩種豬模型更容易誘導(dǎo)成為糖尿病動(dòng)物模型。非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物進(jìn)化程度較高，其功能、代謝、結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，更加接近人類，與人類的關(guān)系極為密切[12]，親緣關(guān)系和藥物反應(yīng)與人類相似，適合做各種疾病模型，其中食蟹猴[13]和恒河猴[14]易分別誘導(dǎo)為2型、1型糖尿病，但是由于此類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的價(jià)格昂貴，飼養(yǎng)的條件要求高，獲得也十分不易，目前應(yīng)用并不是很廣泛。樹(shù)鼩原來(lái)歸屬于食蟲(chóng)目，1945年后改歸于靈長(zhǎng)目，其體型比較小，每隔45天便可繁殖一胎，解剖結(jié)構(gòu)和新陳代謝特征與人相似，已被國(guó)內(nèi)外研究者關(guān)注并成功制作出糖尿病模型[15-18]。嚙齒類動(dòng)物的大鼠被人類稱作精密的“生物工具”，它體型比較小，遺傳學(xué)背景明確，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的反應(yīng)較一致，其中封閉群Wistar大鼠是由美國(guó)Wistar研究所1907年培育出來(lái)，性周期穩(wěn)定，繁殖力較強(qiáng)，產(chǎn)仔多，生長(zhǎng)發(fā)育快，是目前使用最多、最廣泛的品種，現(xiàn)多用于糖尿病并發(fā)癥的研究[19,20]。SD大鼠是美國(guó)Sprague和Dawley農(nóng)場(chǎng)于1925年培育而成，生長(zhǎng)發(fā)育比Wistar快，是另一種常用作糖尿病研究的動(dòng)物[21]。伴隨著小鼠的基因組圖譜的繪制勝利完工，華盛頓基因組測(cè)序中心遺傳學(xué)家Robert Waterston和麻省理工學(xué)院的Whitehead研究所的Kerstin Lindblad-Toh領(lǐng)導(dǎo)的基因組國(guó)際研究聯(lián)盟曾報(bào)道，人類與小鼠都有大約30000多個(gè)基因，其中大約有80%是一樣的，小鼠更多的被用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域中，常用于糖尿病的模型小鼠有ob，db肥胖小鼠等[22]。

2　常見(jiàn)糖尿病動(dòng)物模型

根據(jù)美國(guó)的糖尿病學(xué)會(huì)(ADA)專家委員會(huì)對(duì)糖尿病的分型：即1型糖尿病、2型糖尿病、其他特殊類型糖尿病、妊娠糖尿病，將用于糖尿病研究的模型相應(yīng)的化分為1型糖尿病動(dòng)物模型、2型糖尿病動(dòng)物模型、其他特殊類型糖尿病動(dòng)物模型、妊娠糖尿病動(dòng)物模型，本綜述主要闡述常見(jiàn)的前兩種糖尿病模型：

2.11型糖尿病動(dòng)物模型

1型糖尿病目前分為2個(gè)亞型：免疫介導(dǎo)型和病因未明的特發(fā)型。前者是胰島β細(xì)胞的自身免疫性遭到破壞，患者體內(nèi)能夠檢測(cè)出自身免疫抗體[23]；后者具有典型的1型糖尿病的臨床特點(diǎn)，但沒(méi)有明顯的病因?qū)W發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有自身免疫抗體反應(yīng)的證據(jù)。1型糖尿病模型多從破壞動(dòng)物胰島著手，如成功建立的第一個(gè)1型糖尿病狗模型，之后的1型糖尿病模型建立，多采用全部或部分胰腺切除術(shù)[24]，藥物誘導(dǎo)及手術(shù)切除加誘導(dǎo)聯(lián)用[25]等方法。常用誘導(dǎo)藥物為鏈脲佐菌素(STZ)和四氧嘧啶，前者可以破壞動(dòng)物的胰島β 細(xì)胞，從而使動(dòng)物分泌胰島素不足[18, 26]。鐘近潔等[27]研究者通過(guò)小劑量(50 mg/kg、70 mg/kg、90 mg/kg)多次腹腔注射鏈脲佐菌素成功建立了與人類1型糖尿病極為相似的小鼠模型，他們觀察指標(biāo)是血糖，體重，糖耐量，結(jié)果顯示劑量為70 mg/kg的小鼠造模成模率為75%。小鼠的品系，給藥的劑量，禁食的時(shí)間和飼養(yǎng)膳食的搭配都將會(huì)影響到鏈脲佐菌素誘導(dǎo)1型糖尿病動(dòng)物模型的成功率[28-30]。另一種對(duì)胰島β細(xì)胞分泌功能有損傷作用的藥物是四氧嘧啶(alloxan, ALX)，此藥物是尿酸氧化合成的一種乳黃色粉末，對(duì)胰島β細(xì)胞功能有特異的破壞作用，它終止胰島素的分泌，引起動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)性糖尿病。成雪等[31]成功制作出Beagle犬糖尿病模型，劑量為50 mg/kg時(shí)，造模的成功率為100%。四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病模型的成功率同樣受到體重，劑量等因素的影響。孫昱等[32, 33]比較了鏈脲佐菌素和四氧嘧啶作為誘導(dǎo)劑的不同效果，發(fā)現(xiàn)鏈脲佐菌素靜脈中給藥較為合理安全，腹腔給藥時(shí)則更宜采用四氧嘧啶作為誘導(dǎo)劑。STZ 對(duì)動(dòng)物的胰島β細(xì)胞的毒性作用具有高度的選擇性[34]，選用小劑量多次給予腹腔注射STZ 誘導(dǎo)的1型糖尿病模型能夠引起機(jī)體對(duì)自身胰島的免疫應(yīng)答，造成持續(xù)性的多次胰島β細(xì)胞破壞，此漸進(jìn)性胰島損害與人類的1型糖尿病發(fā)病的機(jī)制及胰島損害比較類似，是目前較為理想的1型糖尿病的動(dòng)物模型[35,36]。以上兩種造模方法，或是手術(shù)切除，或是藥物誘導(dǎo)，均可以模擬出與人類1型糖尿病癥狀極為相似的模型，但是手術(shù)切除有造模麻煩、術(shù)后感染等缺點(diǎn)，多適用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用量少、實(shí)驗(yàn)環(huán)境較為清潔，課題組成員較多且外科手術(shù)精湛的實(shí)驗(yàn)人員使用。藥物誘導(dǎo)的方法較之于手術(shù)方法更為簡(jiǎn)單，研究者經(jīng)一般培訓(xùn)即可掌握造模技術(shù)，成本較低，容易操作，但是由于藥物毒性較烈，所造模型不單單是胰島的損傷，全身器官均有一定的損害，使得所成模型合并其它病，可用此法造模排查新藥，特別是中藥或中藥組方的藥效甄選。

2.22型糖尿病動(dòng)物模型

2型糖尿病約占糖尿病發(fā)病總數(shù)的85%～90%，多數(shù)在30～40歲發(fā)病，伴隨著年齡的增長(zhǎng)，體重的增加，缺乏運(yùn)動(dòng)而增加患病率。由于多數(shù)患者發(fā)病隱匿，很難估算出發(fā)病的時(shí)間，故患者經(jīng)常因?yàn)閲?yán)重的并發(fā)癥而就診。2型糖尿病患者多，程度重使得研究2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展、治療及轉(zhuǎn)歸具有重大的臨床意義。目前用于2型糖尿病的動(dòng)物模型有實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型，自發(fā)性動(dòng)物模型和基因工程動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型常用手術(shù)方法、化學(xué)試劑和高脂飲食誘導(dǎo)而建立，Kurup S等[37]對(duì)BALB /c小鼠行部分胰腺切除術(shù)聯(lián)合使用化學(xué)藥物，誘導(dǎo)出與2型糖尿病很相似的動(dòng)物模型，現(xiàn)在多用在胰腺移植和再生相關(guān)因素的研究中。化學(xué)誘導(dǎo)方法所使用的化學(xué)誘變劑同1型糖尿病，主要是四氧嘧啶和鏈脲佐菌素，Like AA等[38]于1976年第一次用單次腹腔注射或靜脈給予不同劑量的鏈脲佐菌素，發(fā)現(xiàn)了小劑量的鏈脲佐菌素即可成功誘導(dǎo)2型糖尿病，隨后更多的研究人員[39]利用相似方法制作糖尿病的動(dòng)物模型，此類完全使用藥物誘導(dǎo)的方法與人類的發(fā)病機(jī)制差異很大，現(xiàn)已很少使用。自發(fā)性的2型糖尿病模型有GK大鼠、Zuker大鼠、KKAy小鼠、黑線倉(cāng)鼠、NSY小鼠、嗜沙肥鼠和OLETF大鼠等。其中GK大鼠由于其多種優(yōu)點(diǎn)，成為使用較為廣泛的自發(fā)性的糖尿病模型[40]，但自發(fā)性糖尿病鼠的血糖升高并不十分顯著，故與手術(shù)法、藥物誘導(dǎo)和基因工程造模方法比起來(lái)，其使用有較多的限制。

基因編輯技術(shù)(ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9)[41-43]是 DNA 靶向修飾技術(shù)的研究熱點(diǎn)，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)研究，特別是2013年CRISPR 技術(shù)的推廣，它幾乎能讓研究者在任何物種中實(shí)現(xiàn)精確的、快速的基因編輯修飾。這一技術(shù)的出現(xiàn)和廣泛運(yùn)用，使得利用基因敲除和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)來(lái)模擬人類疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程成為一大亮點(diǎn)。短短幾年，該技術(shù)已經(jīng)在人類的多種細(xì)胞系、斑馬魚(yú)、小鼠、果蠅、線蟲(chóng)、小型豬、食蟹猴等動(dòng)物中應(yīng)用[44，45]。利用基因工程技術(shù)，糖尿病方面目前已經(jīng)構(gòu)建出多種模型，如MKR小鼠[46]、NOD小鼠、GK/IRS-1雙基因敲除小鼠、MODY動(dòng)物模型等，其主要相關(guān)的位點(diǎn)是胰島素受體、胰島素受體底物1，2(IRS-1，IRS-2)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT4)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR-γ)以及胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF-1R)等，表1對(duì)近年來(lái)糖尿病基因工程模型進(jìn)行了總結(jié)。2型糖尿病是由多基因聯(lián)合環(huán)境因素、遺傳因素共同引起的，基因工程動(dòng)物模型有價(jià)格昂貴，飼養(yǎng)環(huán)境要求較高和單基因模擬，繁殖時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，不過(guò)科學(xué)的發(fā)展使得技術(shù)難度降低，雙基因甚至多基因同時(shí)修飾的時(shí)代正在到來(lái)，隨之造模價(jià)格高，造模周期長(zhǎng)及單基因模擬的缺點(diǎn)也都將克服。科學(xué)的嚴(yán)謹(jǐn)性要求從控制單一因素來(lái)逐個(gè)探索動(dòng)物乃至人類的某一基因的作用，基因工程使得這一愿望變成現(xiàn)實(shí)，新的糖尿病相關(guān)基因位點(diǎn)不斷發(fā)現(xiàn)，研究單一基因在糖尿病中的作用方式、作用程度使得基因工程模型將在未來(lái)變成一種主流。

為了更清晰了解糖尿病動(dòng)物模型的優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍，根據(jù)其造模方法的不同將以上所述常見(jiàn)糖尿病動(dòng)物模型進(jìn)行了如下分類(表1，表2)。

表1　糖尿病基因工程動(dòng)物模型概括

表2　常見(jiàn)糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型構(gòu)建方法及特點(diǎn)

3　結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展的基本支撐條件之一，是糖尿病研究的強(qiáng)勁幫手，但迄今為止，尚沒(méi)有一種完全模擬人類糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程的動(dòng)物模型，以上所述的1型糖尿病和2型糖尿病模型各具特點(diǎn)也各有缺陷，化學(xué)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型成模率不高，且常在出生后不久發(fā)病而死，自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型血糖升高不顯著，基因工程糖尿病動(dòng)物模型耗時(shí)長(zhǎng)。對(duì)于研究者而言，應(yīng)該根據(jù)其實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑢?shí)驗(yàn)的條件和實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)多少等因素選擇最適當(dāng)?shù)奶悄虿∧Ｐ汀Ｍ瑫r(shí)，期待更完美的方法能夠構(gòu)建出造模時(shí)間短，實(shí)驗(yàn)成本低，成功率高的適用于不同類型研究的糖尿病模型。

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Animal models in diabetes mellitus research

SONG Dan1, 3, RAN Li-yuan1, JIANG Ru-jiao1, WU Ying-jie1,2,3*

(1. Institute of Gene Engineered Animal Models for Human Diseases, Dalian Medical University, Dalian 116044, China;2. The Advanced Institute for Medical Sciences, Dalian Medical University, Dalian 116044, China;3. Institute of Integrative Medicine, Dalian Medical University, Dalian 116044, China)

In spite of much progress on its mechanism, diagnosis and treatment, diabetes mellitus remains a public health challenge. The harm of diabetes is not significantly reduced, instead shows an increasing tendency year by year. To achieve an in-depth and comprehensive understanding of the underlying mechanism, and to develop efficacious, stable and hypoglycemia-risk free drugs, it is crucial to gain more knowledge about diabetes from animal models. In this review, the types of diabetes animal models, modeling methods, the advantages and disadvantages, their applicable scope are discussed aiming to provide a reference for researchers to choose appropriate animal models.

Diabetes mellitus; Animal models; Genetic engineering

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81471000)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20132105110002)。

宋丹(1988-)，女，碩士研究生，專業(yè)：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)。E-mail: songdandan2018@163.com。

吳英杰(1965-)，男，教授，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail: yingjiewu@dmu.edu.cn。

研究進(jìn)展

R-332

A

1671-7856(2016)09-0083-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.015

2016-01-28