伊馬替尼衍生物的合成及其抗腫瘤活性

嚴曉陽, 鄭紹成, 應禮彪

(1. 浙江師范大學 行知學院，浙江 金華　321004； 2. 金華市環境科學研究院，浙江 金華　321017)

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伊馬替尼衍生物的合成及其抗腫瘤活性

嚴曉陽1, 鄭紹成1, 應禮彪2*

(1. 浙江師范大學 行知學院，浙江 金華321004； 2. 金華市環境科學研究院，浙江 金華321017)

以4-硝基-2-氨基甲苯為起始原料，經加成、縮合、環化和還原反應制得中間體N-(2-甲基-5-氨基苯基)-4-(3-吡啶基)嘧啶-2-胺(4)，再與取代酰氯反應，合成了7個新型伊馬替尼衍生物(5a～5g)，其結構經1H NMR,13C NMR和HR-MS 表征。采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法考察了5對人肝癌細胞(HepG-2)、子宮頸癌細胞(Hela)、肺癌細胞(H460)和乳腺癌細胞(MCF-7)體外抑制活性。結果顯示：5e體外抑制活性最優，其IC50分別為10.90±1.00 μmol·L-1； 8.51±0.90 μmol·L-1； 13.15±1.11 μmol·L-1； 14.75±0.78 μmol·L-1。

4-硝基-2-氨基甲苯; 伊馬替尼衍生物; 合成; 四甲基偶氮唑鹽; 抗腫瘤活性

惡性腫瘤，又稱癌癥，是嚴重危害人類生命健康的疾病。2008年世界衛生組織(WHO)發布的《世界癌癥報告》在2008年世界范圍內有1200萬人被確診患有癌癥，其中還有760萬人因癌癥而死亡，而這死亡人數卻占到了全球死亡人數的13%，癌癥的死亡人數預計全球范圍內還會繼續增加，癌癥如果不加以干預，到2030年將有1200萬人因癌癥而死亡，在低收入或中等收入的國家死亡人數占70%[1-3]。設計合成高效的抗腫瘤藥物和改造已有化學藥物是目前化學藥物研發的熱點。

Scheme 1

甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesilate)，化學名為4-[(4-甲基-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-{[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基}苯基-苯胺甲磺酸鹽，由瑞士諾華(Novartis) 公司開發，于2001 年獲得美國食品藥物管理局(FDA)批準上市[4-5]。伊馬替尼可靶向3種酪氨酸激酶受體:C-kit(原癌基因蛋白)、BCR-ABL(癌基因產物)和PDGF(血小板衍生生長因子)受體[6-7]，因此也廣泛應用于其他受體有關的腫瘤疾病的治療。目前甲磺酸伊馬替尼在治療慢性髓細胞白血病上取得了顯著的療效，但是隨著臨床上的應用，其耐藥性和不良反應(如惡心、嘔吐、水腫、皮疹、骨關節及肌肉疼痛、中性粒細胞及血小板減少等)[8-10]相繼出現。因此設計合成伊馬替尼衍生物并考察其生物活性具有重要意義[11]。

本文參考文獻[12-13]方法，以2-甲基-5-硝基苯胺(1)為起始原料,經加成、縮合、環化和還原反應得重要中間體伊馬替胺(4)，再與取代酰氯反應合成了7個新型伊馬替尼衍生物(5a～5g)(Scheme 1)。并對5進行人肝癌細(HepG2)[13]、子宮頸癌細胞(Hela)、肺癌細胞(H460)和乳腺癌細胞(MCF-7)體外抑制活性測試。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

RY-2型熔點儀(溫度未校正)；Varian-Mercury 600型超導核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS 為內標)；Thermo Scientific Q Exactive型高分辨質譜儀。

所用試劑均為分析純。

1.2合成

(1) 2-甲基-5-硝基苯胍(2) 的合成

在干燥的反應瓶中依次加入1 40.0 g(0.26 mol)、單腈胺22.0 g(0.55 mol)和乙醇150 mL，攪拌下滴加濃鹽酸29 mL，滴畢，回流反應15 h。反應液減壓除溶后加入水，于-5～0 ℃滴加硝酸銨的水溶液150 mL(30%)，滴畢，保溫反應1～2 h。過濾，濾餅用乙醚洗滌，干燥得白色固體2 55 g, m.p.222～224 ℃。

(2)N-(2-甲基-5-硝基苯基)-4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-胺(3)的合成

將2 45.0 g ( 0.18 mol )和3-二甲氨基-1-(3-吡啶基)-2-丙烯-1-酮30.7 g( 0.18 mol)溶于異丙醇(200 mL)中，攪拌下加入NaOH 7.7 g(0.20 mol)，回流反應12 h。冷卻至室溫(析出固體)，抽濾，濾餅依次用異丙醇(200 mL)和水(100 mL)洗滌，甲醇重結晶得黃色固體3 46.0 g，收率87%，m.p.195～198 ℃[14]。

(3) 4的合成

在三口瓶中依次加入3 3.3 g(0.01 mol)， DMF 5 mL， 甲醇100 mL和鈀碳0.3 g，通氫氣，于室溫反應至終點。抽濾，濾液蒸干甲醇得粗品，用二氯甲烷重結晶得黃色固體4 2.66 g。收率96%；1H NMRδ: 9.24(d,J=1.83 Hz, 1H), 8.69(dd,J=1.65 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.68(s, 1H), 8.46(d,J=5.13 Hz, 1H), 8.41(td,J=1.88 Hz, 7.98 Hz, 1H), 7.54(dd,J=4.77 Hz, 7.89 Hz, 1H), 7.36(d,J=5.14 Hz, 1H), 6.87(d,J=8.07 Hz, 1H), 6.79(d,J=2.20 Hz, 1H), 6.34(dd,J=2.20 Hz, 8.07 Hz, 1H), 4.85(s, 2H), 2.06(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 161.9, 161.7, 159.8, 151.8, 148.5, 147.2, 138.4, 134.8, 132.8, 130.8, 124.3, 119.8, 111.6, 111.4, 107.5, 17.7; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H16N5{[M+H]+}278.140 0, found 278.140 0。

(4) 5a～5g的合成通法

在反應瓶中加入4 0.276 g (1 mmol)和二氯甲烷10 mL，攪拌下于室溫加入取代酰氯 1 mmol和三乙胺 1 mmol。反應至終點(TLC 跟蹤)(展開劑: A=V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/2)。反應液濃縮后經硅膠柱層析(洗脫劑:A=1/10)純化得5a～5g。

5a: 白色固體，收率82%；1H NMRδ: 10.22(s, 1H), 9.36～9.20(m, 1H), 8.98(s, 1H), 8.69(dd,J=1.65 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.51(d,J=5.13 Hz, 1H), 8.48(td,J=1.95 Hz, 8.02 Hz, 1H), 8.10(d,J=1.83 Hz, 1H), 7.99～7.92(m, 2H), 7.60～7.57(m, 1H), 7.54(s, 1H), 7.54～7.52(m, 1H), 7.52～7.51(m, 1H), 7.49(dd,J=2.11 Hz, 8.16 Hz, 1H), 7.43(d,J=5.13 Hz, 1H), 7.22(d,J=8.25 Hz, 1H), 2.23(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 165.9, 162.1, 161.6, 160.0, 151.8, 148.6, 138.3, 137.6, 135.5, 134.9, 132.7, 131.9, 130.5, 128.8, 128.1, 128.1, 124.3, 117.7, 117.2, 108.0, 18.1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C23H20N5O{[M+H]+}382.166 2, found 382.166 0。

5b: 白色固體，收率81.%;1H NMRδ: 10.11(s, 1H), 9.32(d,J=1.83 Hz, 1H), 9.01(s, 1H), 8.72(dd,J=1.65 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.55(d,J=5.14 Hz, 1H), 8.52(td,J=1.95 Hz, 8.02 Hz, 1H), 8.12(d,J=1.65 Hz, 1H), 8.02～7.97(m, 2H), 7.58～7.54(m, 1H), 7.52(dd,J=2.20 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.46(d,J=5.13 Hz, 1H), 7.24(d,J=8.44 Hz, 1H), 7.13～7.05(m, 2H), 3.87(s, 3H), 2.27(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 165.3, 162.3, 162.1, 161.6, 160.0, 151.8, 148.6, 138.2, 137.8, 134.9, 132.7, 130.5, 130.0, 127.9, 127.5, 124.3, 117.7, 117.2, 114.0, 108.0, 55.9, 18.1； HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C24H22N5O2{[M+H]+}412.176 8, found 412.176 6。

5c: 白色固體，收率78.9%；1H NMRδ: 9.79(s, 1H), 9.26(d,J=1.65 Hz, 1H), 8.92(s, 1H), 8.69(dd,J=1.47 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.50(d,J=5.13 Hz, 1H), 8.46(td,J=1.88 Hz, 7.98 Hz, 1H), 7.90(d,J=1.47 Hz, 1H), 7.55～7.47(m, 1H), 7.42(d,J=5.14 Hz, 1H), 7.28(dd,J=2.02 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.13(d,J=8.25 Hz, 1H), 2.28(t,J=7.43 Hz, 2H), 2.19(s, 3H), 1.58(t,J=7.15 Hz, 2H), 1.38～1.19(m, 8H), 0.85(t,J=6.97 Hz, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 171.5, 162.0, 161.6, 159.9, 151.8, 148.7, 138.2, 137.8, 134.9, 132.7, 130.5, 127.2, 124.2, 116.4, 115.9, 108.0, 40.5, 36.9, 31.6, 29.1, 29.0, 25.7, 22.5, 18.0, 14.4; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C24H30N5O{[M+H]+}404.244 5, found 404.244 4。

5d: 白色固體，收率85.6 %；1H NMRδ: 10.13(s, 1H), 9.30(d,J=1.65 Hz, 1H), 9.00(s, 1H), 8.70(dd,J=1.47 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.57～8.43(m, 2H), 8.10(d,J=1.28 Hz, 1H), 7.88(d,J=8.25 Hz, 2H), 7.55(dd,J=4.77 Hz, 7.89 Hz, 1H), 7.49(dd,J=2.02 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.44(d,J=5.14 Hz, 1H), 7.33(d,J=8.07 Hz, 2H), 7.21(d,J=8.25 Hz, 1H), 2.39(s, 3H), 2.23(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 164.7, 162.1, 161.6, 160.0, 151.9, 148.7, 138.3, 137.4, 136.8, 134.9, 134.2, 132.7, 130.6, 130.1, 129.0, 128.5, 125.3, 117.7, 117.2, 108.0, 19.0, 18.1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C24H22N5O{[M+H]+}396.181 9, found 396.181 9。

5e: 白色固體，收率80.6%；1H NMRδ: 10.48(s, 1H), 9.35(d,J=1.83 Hz, 1H), 9.10(s, 1H), 8.80(dd,J=1.28 Hz, 4.95 Hz, 1H), 8.72(d,J=8.07 Hz, 1H), 8.57(d,J=4.95 Hz, 1H), 8.09(s, 1H), 7.72(dd,J=5.04 Hz, 7.98 Hz, 1H), 7.59(dd,J=1.56 Hz, 7.43 Hz, 1H), 7.57(d,J=8.07 Hz, 1H), 7.51～7.49(m, 2H), 7.48～7.45(m, 1H), 7.40(dd,J=1.83 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.22(d,J=8.25 Hz, 1H), 2.23(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 165.3, 161.4, 161.1, 160.1, 149.4, 146.4, 138.2, 137.6, 137.6, 137.4, 133.7, 131.5, 130.7, 130.4, 130.1, 129.4, 128.2, 127.7, 125.3, 116.8, 116.5, 108.2, 18.1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C23H19N5OCl{[M+H]+}416.127 3, found 416.127 4。

5f: 白色固體，收率82.5%；1H NMRδ: 10.28(s, 1H), 9.28(d,J=2.20 Hz, 1H), 8.99(s, 1H), 8.69(dd,J=1.65 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.52(d,J=5.13 Hz, 1H), 8.48(td,J=1.97 Hz, 7.98 Hz, 1H), 8.09(d,J=1.65 Hz, 1H), 7.99(d,J=8.62 Hz, 2H), 7.64～7.59(m, 2H), 7.52(dd,J=4.77 Hz, 7.89 Hz, 1H), 7.48(dd,J=2.02 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.44(d,J=5.13 Hz, 1H), 7.22(d,J=8.25 Hz, 1H), 2.23(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 164.7, 162.1, 161.6, 160.0, 151.9, 148.7, 138.3, 137.4, 136.8, 134.9, 134.2, 132.7, 130.6, 130.1, 128.9, 128.3, 124.3, 117.7, 117.2, 108.0, 18.1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C23H20N5OCl{[M+H]+}416.127 3, found 416.127 4。

5g: 白色固體，收率80.6%；1H NMRδ: 9.93(s, 1H), 9.26(d,J=2.02 Hz, 1H), 8.91(s, 1H), 8.70(dd,J=1.47 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.50(d,J=5.13 Hz, 1H), 8.47(td,J=1.77 Hz, 8.02 Hz, 1H), 7.90(s, 1H), 7.53(dd,J=4.77 Hz, 7.89 Hz, 1H), 7.42(d,J=5.14 Hz, 1H), 7.27(dd,J=1.83 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.14(d,J=8.25 Hz, 1H), 3.59(s, 3H), 2.61(s, 4H), 2.19(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ： 173.4, 170.0, 162.1, 161.6, 159.9, 151.8, 148.6, 138.3, 137.7, 134.9, 132.7, 130.6, 127.2, 124.3, 116.2, 115.7, 108.0, 51.8, 31.3, 29.0, 18.0; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C21H22N5O3{[M+H]+}392.171 7, found 392.171 8。

1.3抗腫瘤細胞毒活性實驗

采用MTT法[15]測定了5a～5g對HepG2， Hela， H460和MCF-7四種腫瘤細胞的體外抗腫瘤活性[16]。

(1) 待測樣制備

將狀態良好的貼壁細胞(HepG2， Hela， H460， MCF-7)胰酶消化重懸計數，接種于96孔板，每孔細胞數目約104個，CO2培養箱中繼續培養過夜，待細胞貼壁后每孔中加入含不同濃度化合物的無血清培養基(每個濃度設四個復孔，以不加細胞的孔讀數時作空白，加細胞不加化合物的孔作對照孔，作實驗陽性對照)。

(2) 測定方法

將新配的5a～5g的二甲亞砜溶液加入孔中，終濃度分別為5 μmol·L-1，10 μmol·L-1， 20 μmol·L-1， 40 μmol·L-1和80 μmol·L-1。靜置48 h，每孔加入5 mg·ml-1MTT 10 uL ,繼續培養4 h，棄去孔中培養基，每孔加入DMSO 150 uL，酶標儀上于490 nm處測定吸光度值，通過比較對照孔和化合物孔的讀數，分別計算細胞生長抑制率。{抑制率=[(陰性對照組OD值-受試物組OD值) /陰性對照組OD值]×100%}，計算不同濃度下的抑制率，再以此求出各樣品的IC50值。

2　結果與討論

2.1合成

合成3時，我們采用了異丙醇做反應的溶劑，提高了反應溫度，縮短了反應時間。

合成4時，采用鈀碳做催化劑還原硝基，比傳統的鐵粉還原后處理簡單，副產物少，可以直接用于下一步反應。

2.2抗腫瘤活性

表1為5的抗腫瘤活性。由表1可見，5對HepG2， Hela， H460和MCF-7 四種腫瘤細胞有一定的抑制作用。其中5e的細胞毒抑制活性最大。其IC50分別為10.90 μmol·L-1， 8.51 μmol·L-1， 13.15 μmol·L-1和14.75 μmol·L-1。

表1　5a～5g的體外抗腫瘤抑制活性

3　結論

合成了7個新型伊馬替尼衍生物(5a～5g)，采用MTT法研究了5對HepG2， Hela， H460和MCF-7四種腫瘤細胞的體外抗腫瘤活性。結果表明：2-氯-N-{4-甲基-3-[4-(吡啶-3-基)吡啶-2-基氨基]苯基}苯甲酰胺(5e)的細胞毒抑制活性最大。發現芳環上帶吸電子基團氯取代的芳香類伊馬替尼衍生物的抑制活性較高。為今后研究該類化合物結構與活性的關系提供了一定的依據，進一步的結構優化與生物活性研究正在進行中。

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Synthesis and Antitumor Activities of Imatinib Derivatives

YAN Xiao-yang1,ZHENG Shao-cheng1,YING Li-biao2*

(1. College of Xingzhi, Zhejiang Normal University， Jinhua 321004， China; 2. Jinhua City Environmental Science Research Institute， Jinhua 321017， China)

Seven derivatives of imatinib(5a～5g)were prepared by condensation of substituted acid chlorides withN-(5-amino-2-methylphenyl)-4-(3-pyridyl)-2-pyrimidine amine, which was prepared from 2-methyl-5-nitroaniline through the reactions of addition, condensation, cyclization and reduction, respectively. The structures were characterized by1H NMR,13C NMR and HR-MS. Theinvitroantitumor activities of 5a～5g against human hepatoma cells(HepG2), cervical cancer cells(Hela), lung cancer cells (H460) and breast cancer cells(MCF-7) were investgated by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method. The results demonstrated that 5e exhibited good inhibition activities with IC50of 10.90±1.00 μmol·L-1, 8.51±0.90 μmol·L-1, 13.15±1.11 μmol·L-1and 14.75±0.78 μmol·L-1, respectively.

4-nitro-2-amino toluene; imatinib derivative; synthesis; MTT; anti-tumor activity

2016-07-15

嚴曉陽(1976-)，男，漢族，浙江東陽人，碩士研究生，主要從事精細有機合成和藥物化學的研究。 E-mail: eastmorningsun@163.com

應禮彪，工程師， E-mail: jinhuayinggong@163.com

O625.6； O626.1

ADOI： 10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.09.16146