西蘭花中黃酮提取工藝優(yōu)化

陸 英，張 盛，李 海，楊靜思

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.長(zhǎng)沙三福生物科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410100）

西蘭花中黃酮提取工藝優(yōu)化

陸 英1，張 盛1，李 海2，楊靜思1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.長(zhǎng)沙三福生物科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410100）

以市售西蘭花為材料，先對(duì)西蘭花不同部位的黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定；然后以花為原料，考察了乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度4個(gè)單因素對(duì)黃酮提取效果的影響，在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)以期獲得西蘭花總黃酮最優(yōu)提取工藝。結(jié)果表明：西蘭花各部位黃酮含量由高到低依次為：花＞莖＞葉；正交試驗(yàn)的極差分析表明，各因素對(duì)西蘭花總黃酮提取效果影響程度從大到小依次為：料液比＞乙醇濃度＞提取時(shí)間＞提取溫度；方差分析表明，料液比和乙醇濃度具有顯著性影響；最佳提取工藝條件為：乙醇濃度70%，提取溫度85 ℃，料液比1∶3，提取時(shí)間 1.5 h，在此條件下黃酮提取量為18～20 mg/g，提取物干物中黃酮含量達(dá)10%以上。

西蘭花；黃酮；提取；工藝優(yōu)化

西蘭花又名綠菜花、青花菜，它不僅含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還含有硫代葡萄糖苷的酶解產(chǎn)物或衍生物以及豐富的抗壞血酸和黃酮類物質(zhì)［1-3］，具有多種藥用價(jià)值。硫代葡萄糖苷的酶解產(chǎn)物蘿卜硫素或衍生物被認(rèn)為具抗癌作用［4-6］，抗壞血酸具有很強(qiáng)的抗氧化能力，同時(shí)也能增強(qiáng)肝臟解毒功能；黃酮類化合物也是天然的抗氧化劑，不僅能減少心血管疾病的發(fā)生，而且對(duì)高血壓、心臟病有調(diào)節(jié)和預(yù)防作用［7］。因此，西蘭花具有廣闊的開發(fā)利用前景。

關(guān)于西蘭花中總黃酮的提取方法及工藝已有相關(guān)報(bào)道，多采用超聲提取方法［8-9］或高濃度乙醇提取［10］，均不適用于工業(yè)化應(yīng)用。同時(shí)，大部分研究都沒有對(duì)原料含量進(jìn)行篩選，產(chǎn)品含量不明確。因此，試驗(yàn)首先對(duì)西蘭花不同部位的黃酮含量進(jìn)行定性定量分析，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了工業(yè)化提取西蘭花總黃酮的工藝條件，旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用西蘭花奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)試劑

供試西蘭花2015年11月購于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

主要試驗(yàn)試劑有蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度95%，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉（國(guó)產(chǎn)分析純）；95%食用乙醇、色譜甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；

主要試驗(yàn)儀器有LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；Cl8色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，WondasilTM）； UV-2100型紫外可見分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司）；微型植物粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理 西蘭花按葉、莖、花分離（頂端細(xì)莖2～3 cm及花按花處理，主要膨大部分為莖），各部位在60℃低溫干燥后用粉碎機(jī)粉碎，保存待用。

1.2.2 西蘭花提取液高效液相色譜（HPLC）分析

采用C18 色譜柱，A泵進(jìn)水（0.5%冰醋酸），B泵進(jìn)甲醇，按下列方式梯度洗脫：0 min（A：88%，B：12%）→15 min（A：75%，B：25%）→35 m in（A：65%，B：35%），流速1 mL/m in；輸出波長(zhǎng)330 nm，柱溫35℃。提取色譜峰的紫外光譜，分析化合物類型。1.2.3 西蘭花中總黃酮的檢測(cè) 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.55 mg置于10 m L容量瓶中，用70%乙醇溶解定容，搖勻。精密吸取該蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL分別置于10 mL容量瓶中，加入70 %乙醇補(bǔ)充至2.0 m L；加入0.4 m L 5 %的NaNO2溶液，搖勻放置6 min；加入0.4 mL 10 % Al（NO3）3溶液，搖勻后再放置6 m in；加入4 mL 5% NaOH溶液，最后用70 %乙醇定容，搖勻后放置10 min，以樣品空白調(diào)零，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，每個(gè)濃度平行測(cè)定2次。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 西蘭花不同部位總黃酮提取效果考察 準(zhǔn)確稱取西蘭花不同部位材料2.0 g，用20倍甲醇70 ℃回流提取1 h，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定并計(jì)算提取液中黃酮含量，考察西蘭花不同部位總黃酮提取效果，為后續(xù)試驗(yàn)材料選擇提供依據(jù)。

1.2.5 西蘭花總黃酮提取工藝單因素試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取2.0 g西蘭花花部粉末若干份，依次進(jìn)行乙醇濃度（設(shè)40、50、60、70、80% 5個(gè)梯度，固定溶劑用量為40 m L，溫度80℃，時(shí)間2.0 h）、溶劑用量（設(shè)溶劑用量（m L）為原料質(zhì)量（g）的5、10、20、30、40倍 5個(gè)梯度，固定乙醇濃度60%，溫度80℃，時(shí)間2.0 h）、提取溫度（設(shè)50、60、70、80、90℃ 5個(gè)梯度，固定乙醇濃度60%，溶劑用量60 mL，時(shí)間 2.0 h）、提取時(shí)間（設(shè)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h 5個(gè)梯度，固定乙醇濃度60%，溶劑用量60 mL，溫度85℃）的單因素試驗(yàn)，測(cè)定提取液中的黃酮量，確定單因素提取參數(shù)。1.2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件 將上述確定的4個(gè)單因素值左右各設(shè)1個(gè)水平，然后用正交表L9（34）安排4因素3水平試驗(yàn)，以提取量為指標(biāo)，通過極差分析和方差分析確定各因素對(duì)提取效果的影響程度，獲得最優(yōu)提取工藝條件。

1.3 最優(yōu)工藝驗(yàn)證

取樣品20.0 g 2份，按確定的最優(yōu)工藝條件進(jìn)行提取，測(cè)定提取液中黃酮提取量及干物率，計(jì)算干粉質(zhì)量及黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 西蘭花提取液HPLC分析

西蘭花甲醇提取液HPLC見圖1，由圖1可知，西蘭花中化學(xué)成分組成復(fù)雜，PDA檢測(cè)器顯示色譜圖中保留時(shí)間在14～28 m in內(nèi)的化合物的紫外吸收光譜在300～400 nm和240～280 nm 有較大吸收峰，見圖2，符合黃酮類化合物的紫外吸收特征，主要為簡(jiǎn)單黃酮和黃酮醇類［11］。

圖1 西蘭花提取液HPLC圖譜

圖2 西蘭花組分的UV圖譜

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁質(zhì)量濃度x與吸光值y的標(biāo)準(zhǔn)典線見圖3，從圖3中可以看出，回歸方程為：у=12.193x-0.014， R2=0.995 9，線性關(guān)系良好。

2.3 西蘭花不同部位中黃酮的提取效果

從圖4中可以看出，西蘭花不同部位的黃酮含量差異較大，總的來講，各部位黃酮含量由高到低排列依次為花＞葉＞莖，為提高提取物中的黃酮含量，以西蘭花的花為提取原料較好。

圖3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 西蘭花不同部位黃酮含量

2.4 提取單因素試驗(yàn)

2.4.1 乙醇濃度對(duì)西蘭花黃酮提取的影響 從圖5可以看出，隨著乙醇濃度的增大，西蘭花總黃酮提取量隨之升高。當(dāng)濃度大于60%后，黃酮提取量不在繼續(xù)升高，因此確定乙醇濃度為60%。

圖5 乙醇濃度對(duì)西蘭花黃酮提取的影響

2.4.2 溶劑用量對(duì)西蘭花黃酮提取的影響 由圖6可知，隨著溶劑用量的增大，黃酮提取量也隨之升高；當(dāng)溶劑用量大于30倍以后，提取量趨于平緩，因此溶劑用量（m L）為原料質(zhì)量（g）的30倍較為合適。

2.4.3 提取溫度對(duì)西蘭花黃酮提取的影響 從圖7可見，隨著溫度的升高，西蘭花黃酮提取量也是逐漸升高，當(dāng)溫度超過80℃后升高趨勢(shì)變緩，這是因?yàn)闇囟冗^高將導(dǎo)致乙醇損失較大，因此選擇85℃作為最適提取溫度。

圖6 料液比對(duì)西蘭花黃酮提取效果的影響

圖7 溫度對(duì)西蘭花黃酮提取效果的影響

2.4.4 提取時(shí)間對(duì)西蘭花黃酮提取的影響 從圖8可見，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，西蘭花黃酮提取量持續(xù)上升，提取2 h后上升趨勢(shì)變緩，由于提取時(shí)間過長(zhǎng)不利于提高生產(chǎn)效率，因此選擇2 h為最佳提取時(shí)間。

圖8 提取時(shí)間對(duì)西蘭花黃酮提取的影響

2.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取條件

根據(jù)單因素確定的條件設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)因素水平面見表1。從表2可以看出，各因素對(duì)西蘭花黃酮化合物提取影響程度大小依次為：料液比＞乙醇濃度＞提取時(shí)間＞提取溫度，最佳提取工藝條件為：A2B1C2D3，即提取溫度85 ℃，提取時(shí)間1.5 h，料液比1∶30，乙醇濃度70%。同時(shí)從表3可知，料液比和乙醇濃度在試驗(yàn)條件下對(duì)西蘭花黃酮提取具有顯著性影響，時(shí)間和溫度不具顯著性影響。

表1 因素水平設(shè)計(jì)表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.6 最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果2份20 g樣品按上述確定的最優(yōu)工藝條件提取，測(cè)得黃酮提取量分別為19.92、18.53 mg/g，均優(yōu)于正交試驗(yàn)組合，說明該工藝方案可行，重現(xiàn)性好；干物質(zhì)質(zhì)量分別為3.85、3.69 g，黃酮含量為10.34%、

10.05 %。

3 結(jié)論與討論

文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)西蘭花中含有黃酮類化合物，但其化學(xué)組成卻并未見報(bào)導(dǎo)。試驗(yàn)對(duì)西蘭花甲醇提取液進(jìn)行HPLC分析，發(fā)現(xiàn)其中含有多個(gè)化學(xué)成分，通過UV光譜特征分析，發(fā)現(xiàn)這些化學(xué)成分在300～400 nm 和240～280 nm間有較大吸收峰，可推測(cè)為黃酮類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步分離純化后進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

對(duì)西蘭花不同部位的黃酮含量提取結(jié)果表明，黃酮類化合物在西蘭花莖、葉、花中含量差異較大，可能與黃酮類化合物的合成、運(yùn)輸、積累有關(guān)，黃酮類化合物的形成以光合作用為基礎(chǔ)，而花中的光合作用最強(qiáng)，故這一部位的黃酮類化合物含量最高。因此，以花為提取原料能獲得較高的黃酮含量。

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，料液比和乙醇濃度對(duì)西蘭花黃酮提取具有顯著性影響。因此，在實(shí)踐中需嚴(yán)格控制料液比和乙醇濃度，方能得到最佳試驗(yàn)結(jié)果。工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，在提取溫度85 ℃、提取時(shí)間1.5 h、料液比1∶30、乙醇濃度70%的工藝條件下，西蘭花中黃酮的提取量為18～20 mg/g，明顯高于其他工藝條件，提取物中黃酮含量達(dá)10%以上，為西蘭花資源的深加工以及西蘭花功能性食品、保健品的開發(fā)提供了依據(jù)。

［1］ Bertelli D，Plessi M，Braghiroli D，et al. Separation by solid phase extraction and quantification by reverse phase HPLC of sulforaphane in broccoli［J］. Food Chemistry，1998，63（3）：417-421.

［2］ Munyaka A W，Oey I，Loey A V，et al. Application of thermal inactivation of enzymes during vitamin C analysis to study the influence of acidification，crushing and blanching on vitam in C stability in broccoli（Brassicaoleracea var. Italica）［J］. Food Chemistry，2010，120（2）：591-598.

［3］ Gliszczyńska?w ig?o A，Ciska E，Paw lakLemańska K. Changes in the content of health-promoting compounds and antioxidant activity of broccoli after domestic processing［J］. International Journal of Molecular Sciences，2006，23（11）：7481-7494.

［4］ Fahey J W，Zhang Y S，Talalay P. Broccoli sprouts：An exceptionally rich source of inducers of enzymes that protect against chemical carcinoge ns［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，1997，94（19）：10367-10372.

［5］ M atusheski N V，Juvik J A，Jeffery E H. Heating decreases epithiospecifier protein activity and increases sulforaphane formation in broccoli［J］. Phytochemistry，2004，65（9）：1273-1281.

［6］ Cover C M，Hsieh S J，Tran S H，et al. Indole-3-carbinol inhibits the expression of cyclin-dependent kinase-6 and induces a G1 cell cycle arrest of human breast cancer cells in dependent of estrogen receptor signaling［J］. Journal of Biological Chemistry，1998，273：3838-3847.

［7］ 丁云花，簡(jiǎn)元才. 具有保健作用的營(yíng)養(yǎng)蔬菜——青花菜［J］. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2003，（9）：47-49.

［8］ 方秀兵，黃穎麗，徐國(guó)英，等. 西蘭花總黃酮的制備及體外抗腫瘤活性研究［J］. 江西醫(yī)藥，2013，48（5）：397-399.

［9］ 陳建福，施偉梅. 響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶輔助提取西蘭花總黃酮［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014， 32（3）：298-304.

［10］ 周向軍，高義霞，汪之波，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化西蘭花總黃酮提取工藝的研究［J］. 資源開發(fā)與市場(chǎng)，2010，（6）：488-489.

［11］ 陳業(yè)高. 植物化學(xué)成分［M］. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

（責(zé)任編輯：成 平）

Optim ized Extraction Technology of flavonoids in Broccoli

LU Ying1，ZHANG Sheng1，LI Hai2，YANG Jing-shi1
（1. College of Horticulture and Landscape， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC；2. Changsha Sanfu Bio-tech Co.， Ltd ， Changsha 410100， PRC）

Taking commercial broccoli as materials， the f rst favonoid content in different parts of broccoli were determ ined； and then took the part of the flower as raw material， the effects of ethanol concentration， material liquid ratio， extraction time and extraction temperature on the extraction result of Flavonoids were investigated， in order to obtain the optimal extraction technology of total favonoids of broccoli were studied by orthogonal test on the basis of single factor. The results showed that the f avonoids content in different parts of broccoli from high to low： fower ＞ stem ＞leaf； the range analysis of orthogonal test showed that， the effect of factors infuence from high to low： material liquid ratio＞ ethanol concentration＞ extraction time＞ extraction temperature； variance analysis showed that material liquid ratio and ethanol concentration had signif cant inf uence； the best extraction conditions were： ethanol concentration 70%， extraction temperature 85 ℃， material liquid ratio of 1： 30， extraction time 1.5 hour， under the conditions of favonoids extraction amount was 18～20 mg/g， the extract of favonoids content of dry matter was more than 10%.

broccoli； favonoids； extraction； technology optim ization

TS202.3

A

1006-060X（2016）09-0077-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.09.022

2016-07-14

湖南省科技廳項(xiàng)目（2015NK3004 ）

陸 英（1970-），女，湖南古丈縣人，副教授，主要從事植物功能成分分離純化研究。

張 盛