側孢芽孢桿菌C5發酵條件及培養基的優化

吳迎奔，陳 薇，賀月林，許麗娟，王 震，汪 彬

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

側孢芽孢桿菌C5發酵條件及培養基的優化

吳迎奔，陳 薇，賀月林，許麗娟，王 震，汪 彬

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

為了更加有效地利用側孢芽孢桿菌C5，研究了該菌株的生長特性，并對其發酵條件及培養基進行了優化。結果表明，側孢芽孢桿菌C5的生長規律為：0～4 h延滯期，4～16 h指數期，16 h后進入穩定期；最佳發酵條件為：初始pH值7.0、培養溫度30℃、接種量3%～5%、轉速180 r/min；最適培養基為：葡萄糖20.0 g/L、酵母膏10.0 g/L、MnSO40.2 g/L、CaCl20.3 g/L、KH2PO40.1 g/L、MgSO40.05 g/L。在上述條件下，側孢芽孢桿菌C5的發酵芽孢數可達1.08×109CFU/m L。

側孢芽孢桿菌；發酵；條件；培養基；優化

芽孢桿菌已廣泛應用于農業［1-3］、醫藥衛生［4］等領域，其中側孢芽孢桿菌具有解磷鉀、固氮等生物學特性［5-8］，能產生具有應用潛力的代謝產物，例如殺蟲蛋白、抑菌物質等［9］。國內外對側孢芽孢桿菌的研究主要集中于殺蟲［10］、保健類藥物［11］的開發等方面。由湖南省微生物研究院篩選的側孢芽孢桿菌C5，被證實可抑制水體中有害微生物的生長，并能有效分解水中的有機質，凈化水質［12］。現對該菌株的生長特性進行研究，并在此基礎上對其產芽孢發酵培養基進行優化，為其產業化發展提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試側孢芽孢桿菌C5由湖南省微生物研究院篩選。供試培養基有：（1）LB培養基，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，牛肉膏3 g，蒸餾水1 L，pH 值7.0；（2）基礎發酵培養基，葡萄糖10 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 0.5 g，蒸餾水1 L，pH值7.0～7.2；（3）發酵培養基，根據需要具體配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 生長曲線測定 從LB斜面挑取一接種環的菌苔接種于100 m L基礎發酵培養基中，于30℃、180 r/ min恒溫搖床震蕩培養48 h。培養期間每隔3 h取液態樣品測定菌體生長吸光度（OD600）。

1.2.2 芽孢桿菌菌種制備 將斜面菌種接種1環至液體種子培養基中，培養至對數期。以1%接種量轉接到裝有100 m L發酵液的500 mL三角瓶中，37℃、180 r/m in培養10 h。

1.2.3 細菌數、芽孢數的測定 細菌濃度采用細菌計數板計數法測定；發酵液產芽孢率（芽孢數）采用結晶紫染色法測定［12］。

1.2.4 發酵條件的優化 （1）初始pH值的選擇。調基礎培養基的pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，按1%的接種量接種，37℃，180 r/m in發酵培養24 h，測定發酵液的芽孢數，確定最佳初始pH值。（2）溫度的選擇。按1%接種量將種齡18～22 h的種子液轉接到最佳初始pH值的基礎培養基上，分別置于25、30、35、40和45℃搖床上發酵培養，轉速為180 r/ min，發酵培養24 h后測定發酵液的芽孢數，確實最適培養溫度。（3）接種量的選擇。在最佳初始pH值條件下，分別接種1%、3%、5%、7%、10%的種子液于最佳溫度培養下以180 r/m in的轉速發酵培養24 h，測定發酵液的芽孢數，確實最佳接種量。（4）轉速的選擇。在最佳初始pH值和最佳接種量的基礎上，分別以120、150、180、210 r/min的轉速于最佳溫度培養下發酵培養24 h，測定發酵液的芽孢數，確定最佳轉速。

1.2.5 發酵培養基的優化 （1）碳源。分別用10 g/L葡萄糖、淀粉、蔗糖和玉米淀粉作為碳源，其他組分不變，在最佳發酵條件下培養24 h后測定發酵液中芽孢桿菌活菌數和芽孢形成率［5-6］，確定最佳碳源。（2）氮源。分別以10 g/L尿素、牛肉膏、工業蛋白胨、酵母膏4種氮源作為唯一氮源進行發酵培養，在最佳發酵條件下培養24 h后測定發酵液中芽孢桿菌活菌數和芽孢形成率，確定最佳氮源。

1.2.6 正交試驗 在單因素試驗基礎上，以發酵液中芽孢桿菌芽孢數為考察指標，以玉米淀粉為碳源，酵母膏為氮源，CaCl2和MnSO4為無機鹽因素，設計正交試驗（表1），應用L9（34）正交表對各組分用量進行優化。

表1 芽孢桿菌發酵培養基正交試驗設計 （g/L）

2 結果與分析

2.1 生長曲線

由圖1可知，側孢芽孢桿菌C5的生長規律為：0～4 h延滯期，4～16 h指數期，16 h后進入穩定期，由于后期形成大量芽孢，OD值變化不明顯。

圖1 側孢芽孢桿菌C5生長曲線

2.2 發酵條件的優化

2.2.1 初始pH值 從圖2可知，當初始pH值為7.0時，發酵24 h后側孢芽孢桿菌C5的菌體數和芽孢數均達到最多，分別為8.6×108和6.6×108CFU/mL，初始pH值太高或太低均不利于菌體生長和芽孢形成。

圖2 不同pH值對側孢芽孢桿菌C5生長的影響

2.2.2 培養溫度 由圖3可知，當培養溫度為30℃時，側孢芽孢桿菌C5的菌體數和芽孢數達到最高，分別為9.3×108和7.3×108CFU/m L。

圖3 不同溫度對側孢芽孢桿菌C5生長的影響

2.2.3 接種量 從圖4可知，在一定范圍內，側孢芽孢桿菌C5發酵液中的菌體數和芽孢數隨接種量的增加而增加，但當接種量＞5%時，菌數和芽孢數呈下降趨勢。因為3%接種量和5%接種量菌數及芽孢數差別不大，從經濟角度出發，在后續試驗中選擇3%的接種量。

圖4 不同接種量對側孢芽孢桿菌C5生長的影響

2.2.4 轉 速 如圖5所示，當搖床轉速為180 r/min時，側孢芽孢桿菌C5的菌體數和芽孢數均最多。故將側孢芽孢桿菌C5的搖床轉速確定為180 r/min。

圖5 不同轉速對側孢芽孢桿菌C5生長的影響

2.3 發酵培養基的優化

2.3.1 碳 源 從圖6中可以看出，不同碳源對側孢芽孢桿菌C5發酵的菌體數和芽孢數有不同的影響，其中葡萄糖作為碳源的效果最好，發酵結束后菌體書和芽孢數分別為1.23×109和9.7×109CFU/mL，因此選擇葡萄糖為側孢芽孢桿菌C5培養基的碳源。

圖6 不同碳源對側孢芽孢桿菌C5生長的影響

2.3.2 氮 源 由圖7可知，側孢芽孢桿菌C5在含有酵母膏的培養基中活菌數、芽孢數最高，分別達1.39×109和1.03×108CFU/m L，因此選擇酵母膏作為側孢芽孢桿菌C5培養基的碳源。

圖7 不同氮源對側孢芽孢桿菌C5生長的影響

2.4 正交試驗結果

由表2可知，影響側孢芽孢桿菌C5發酵水平主次因素關系為：葡萄糖＞酵母膏＞MgSO4＞CaCl2，因素間最佳水平組合為A3B2C3D3。結合無機鹽的篩選，添加其他3種可以提高發酵水平的無機鹽，側孢芽孢桿菌C5的最佳發酵培養基為：葡萄糖20.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，MnSO40.2 g/L，CaCl20.3 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO40.05 g/L。在此條件下，側孢芽孢桿菌C5的發酵芽孢數可達1.08×109CFU/m L。從表3的方差分析結果可知：F葡萄糖=58.597＞F0.05（2，2）=19.00，說明葡萄糖的作用達到顯著水平。因此，在發酵過程中要嚴格控制葡萄糖的用量，其他因素的作用未達顯著水平。

表2 側孢芽孢桿菌C5培養基濃度的正交試驗結果

表3 側孢芽孢桿菌C5正交試驗方差分析

3 結 論

選取物料投入產出比高，適宜工業化發酵，來源容易、價格低廉、菌體數和芽孢數高的葡萄糖作為培養基中的碳源成分，酵母膏作為培養基中的氮源成分。試驗結果表明，側孢芽孢桿菌C5的生長規律為：0～4 h延滯期，4～16 h指數期，16～32 h穩定期，32 h以后衰亡期；最佳發酵條件為：初始pH值 7.0，培養溫度30℃，接種量3%～5%，轉速180 r/min；最適培養基為：葡萄糖20.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，MnSO40.2 g/L，CaCl20.3 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO40.05 g/L。在上述條件下，側孢芽孢桿菌C5的發酵芽孢數可達1.08×109CFU/m L。

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（責任編輯：成 平）

Optim izing Fermentation Condition for Bacillus laterosporus C5

WU Ying-ben，CHEN Wei，HE Yue-lin，XU li-juan，WANG Zhen，WANG Bin
（Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， PRC）

In order to use Bacillus laterosporus C5 efficiently in production， the Growth characteristics were studied， and the liquid fermentation medium and fermentation conditions were optim ized. The results show ed that the optimal fermentation conditions were initial pH 7.0， temperature 30 ℃， inoculation rate 3%-5%， and rotate speed 180 r/min； the optimum medium was glucose 20.0 g/L， yeast extract 10.0 g/L， MnSO40.2 g/L， CaCl20.3 g/L， KH2PO40.1 g/L， MgSO40.05 g/L. Under the conditions， the spore yield with optimum medium formula was up to 1.08×109CFU/m L。

Bacillus laterosporus； fermentation conditions； condition； culture medium； orthogonal optimization

Q939.96

A

1006-060X（2016）09-0004-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.09.002

2016-07-14

湖南省科技計劃（2015CK3008）；湖南省生豬產業技術體系生豬產業規模養殖與環境控制崗位項目

吳迎奔（1981-），男，湖南新化縣人，助理研究員，主要從事農業微生物等相關研究。

汪 彬