甘蔗開放式組織培養快繁技術研究

李 松，劉紅堅，劉 欣，劉俊仙，余坤興，盧曼曼，劉麗敏，何毅波

（廣西壯族自治區農業科學院甘蔗研究所，廣西蔗糖產業協同創新中心，廣西 南寧 530007）

甘蔗開放式組織培養快繁技術研究

李 松，劉紅堅，劉 欣，劉俊仙，余坤興，盧曼曼，劉麗敏，何毅波

（廣西壯族自治區農業科學院甘蔗研究所，廣西蔗糖產業協同創新中心，廣西 南寧 530007）

以濃度為1 000 mg/L次氯酸鈉為抑菌劑，在甘蔗開放式組織培養條件下，對MS培養基中的無機鹽、蔗糖、激素等因素進行調整試驗，觀察甘蔗腋芽誘導分化芽數、增殖情況等。結果表明：（1）在抑菌劑作用下，污染率高低與無機鹽濃度、6-BA濃度高低不呈相關性，但污染率隨蔗糖濃度的提高而提高；（2）無機鹽濃度、蔗糖濃度高低對甘蔗腋芽誘導分化有影響，規律性不明顯；甘蔗腋芽誘導分化率隨6-BA濃度的提高而提高；（3）無機鹽、6-BA、蔗糖等因素隨濃度的增加對芽的繁殖有促進作用。

自1934年美國學者White等用番茄（Lycopersicume scuien-tum）根首次建立無性繁殖系以來，植物組織培養技術作為生物技術的重要組成部分，越來越受到人們的關注，時至今日，各種植物幾乎都有進行組織培養的報道，該技術作為一種高效的植物快速繁殖技術顯示出了巨大的應用價值。甘蔗是我國重要的糖料作物，其種植面積、產糖量均占全國總量的90%左右。甘蔗屬無性繁殖作物，生長時間長、用種量大，其繁殖速度慢，大大限制了新良種的推廣應用。從20世紀70年代開始，我國應用植物組培技術進行甘蔗生物快繁研究，工廠化培育甘蔗組培苗已有40 a以上的歷史［1］。由于傳統甘蔗組織培養要求嚴格的無菌環境，需要特定的儀器設備、繁雜的操作程序及技術要求，生產成本高，這大大地限制了該技術的應用和推廣。為了簡化組織培養程序，降低生產成本，借鑒前人［2］在荸薺［3］、白菜［4］、香蕉［5-6］、魔芋［7-9］、紅豆杉［8］、梅花［10］和馬鈴薯［11］等植物建立的開放式組織培養技術體系，開展相關技術研究，篩選出次氯酸鈉可應用于甘蔗開放式組織培養（相關研究結果已撰寫論文待發表）。試驗以1 000 mg/L次氯酸鈉為抑菌劑，通過對培養基中蔗糖、無機鹽、激素等用量進行調整，研究開放式組織培養條件下的甘蔗快繁技術，為甘蔗開放式組織培養提供較佳的組培快繁技術實踐依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試甘蔗品種為新臺糖22號；次氯酸鈉購于南寧市精密儀器儀表有限公司，有效濃度為10%。

1.2 試驗方法

試驗以不同濃度的無機鹽、蔗糖、激素各設3個處理，處理組的MS培養基中加入次氯酸鈉溶液，濃度1 000 mg/L，分裝在250 m L培養瓶中，pH值5.8；對照組MS培養基中不加次氯酸鈉溶液。每個處理設3個重復，每個重復接種100個腋芽。試驗培養基不經過高溫滅菌，接種在相對潔凈的普通實驗室進行；對照培養基經過高溫滅菌，消毒、接種、培養等按組織培養常規操作進行；接種后每15 d更換一次新鮮培養基，30 d觀察甘蔗腋芽分化情況，60 d統計叢芽增殖生長狀況。

1.2.1 無機鹽濃度處理 無機鹽設4個濃度處理，培養基配方為：A1：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；A2：1/2 MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；A3：1/4 MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；A4：1/8 MS +BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；ACK：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L。

1.2.2 蔗糖濃度處理 蔗糖設4個濃度處理，培養基配方為：B1：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖10 g/L；B2：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗 糖20 g/L；B3：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗 糖30 g/L；B4：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖40 g/L；BCK：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L。

1.2.3 激素濃度處理 激素以6-BA進行相關濃度試驗。設4個濃度處理，培養基配方為：C1：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；C2：MS+BA 1.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L蔗 糖+30 g/L；C3：MS+BA 2.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；C4：MS+BA 2.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；CCK：MS+BA 1.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L。

1.3 觀察內容及方法

1.3.1 污染率 試驗材料轉瓶后第3 d開始，每隔2 d調查1次，把污染瓶去掉并記錄。污染率=污染瓶數/轉瓶總數×100%。

1.3.2 腋芽誘導分化率 試驗材料轉瓶后第10 d開始，每隔4 d調查1次腋芽萌發生長情況，以腋芽萌發出新苗為準，得出腋芽誘導分化率。腋芽誘導分化率=腋芽萌發數/接種腋芽總數×100%（污染瓶數不列入統計）。

1.3.3 腋芽增殖速度 腋芽接種培養90 d后，統計每芽系（瓶）的苗數，計算腋芽增殖苗數。腋芽增殖苗數=總苗數/接種腋芽總數（污染瓶數不列入統計）。

1.4 數據分析

試驗數據收集整理采用Excel表，方差分析采用DPS數據處理系統Duncan新復極差法進行。

2 結果與分析

2.1 不同無機鹽濃度處理對甘蔗組培苗繁育的影響

由表1可見，在污染方面，污染率最低為ACK處理，只有4.33%，最高為A2處理，6.00%，經方差分析，各處理污染差異不顯著；在甘蔗腋芽誘導分化率方面，分化率最高為ACK處理，達85.62%，其余處理從高到低依次為：A2＞A1＞A4＞A3，經方差分析，ACK與A1、A2和A4差異不顯著，與A3差異達顯著水平；在芽增殖方面，以ACK最多，平均每個腋芽繁殖20.2株，其次是A1，為16.5株，A2為15.3株，A4最少，只有12.9株苗，經方差分析，ACK與各處理均達極顯著水平，A1與A2差異不顯著，A1與A3差異達顯著水平，A1與A4差異達極顯著。

表1 不同無機鹽濃度處理對甘蔗組培苗繁育的影響

2.2 不同蔗糖濃度處理對甘蔗組培苗繁育的影響

由表2可見，在污染方面，污染率最低為B1處理，4.00%，最高為B4處理，6.67%，經方差分析，BCK與各處理差異不顯著；在甘蔗腋芽誘導分化率方面，分化率最高為B4處理，84.13%，其余處理從高到低依次為：BCK＞B2＞B1＞B3。經方差分析，BCK與B3差異達極顯著水平，與其他處理差異不顯著；在芽增殖方面，以BCK最多，平均每個腋芽繁殖23.7株，其次是B3，為19.5株；B1最少，只有8.2株。經方差分析，BCK與各處理差異均達極顯著水平，B3、B4間差異不顯著，與B1、B2差異達極顯著水平。

表2 不同蔗糖濃度處理對甘蔗組培苗繁育的影響

2.3 不同激素濃度處理對甘蔗組培苗繁育的影響

由表3可見，在污染方面，污染率最低為C4處理，只有4.00%，最高為C3處理，6.00%，經方差分析各處理間差異不顯著；在腋芽誘導分化率方面，分化率最高為CCK處理，87.4%，其余處理從高到低依次為：C3＞C4＞C2＞C1。經方差分析，BCK與各處理差異均達極顯著水平，C3、C4間差異不顯著，與C1、C2差異達極顯著水平；在芽增殖方面，以CCK最多，平均每個腋芽繁殖24.1株，其次是C3，為22.8株，C1最少，只有19.6株，方差分析各處理間差異情況與腋芽誘導分化率相似。

表3 不同激素濃度處理對甘蔗組培苗繁育的影響

3 討論與結論

培養基中的無機鹽為植物組織培養過程提供必需的大量元素和微量元素，是植物細胞和組織生長必不可少的，缺少這些物質會導致生長、發育異常。無機鹽濃度試驗結果表明，在開放式培養中，污染率最低為對照，但對照與各處理間污染率差異不顯著，說明無機鹽濃度高低對污染率影響不大；對甘蔗腋芽誘導分化有影響，但沒有規律性；對苗的增殖影響最大，隨無機鹽濃度的降低，甘蔗組培苗增殖數量而減少，且因營養不足蔗苗生長也表現出比較弱小。綜合污染率、芽分化、苗增殖等因素考慮，在開放式培養中無機鹽濃度以原MS基本培養基濃度為宜。

植物組織培養過程以自養為主、異養為輔的寄生型育苗過程。植物所需的碳源和能量大部分由培養基中的蔗糖提供，同時，蔗糖也是微生物孳生的主要原因。試驗結果表明，蔗糖濃度為1%時污染率最低，隨著蔗糖濃度的提高，污染率有上升的趨勢，研究結果與吳桂容等［3］在荸薺的開放式組織培養中相似。蔗糖濃度的高低對芽分化有一定的影響，但影響差異不大，其原因可能是接的芽組織較大，自身攜帶有一定的營養物質供其在分化過程中利用；雖然隨著蔗糖濃度的提高其污染率升高，但其芽繁殖數也隨之升高，3%的蔗糖濃度有利于甘蔗繁殖，結果與趙青華等［9］在磨芋的開放式組織培養中研究相似。綜合污染率、芽分化、苗增殖等因素考慮，在開放式培養中蔗糖濃度以3%較適宜。

組織培養中不同植物所需的激素的種類和濃度不同；同一植物，不同的培養階段其所需的激素的種類和濃度也不同。在甘蔗組培快繁中，常用的激素種類相對簡單，愈傷組織脫分化為2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、愈傷組織再分化與組培苗增殖為6-BA（6-芐氨基腺嘌呤）與NNA（萘乙酸）、生根培養為NAA。試驗中以甘蔗腋芽為供體，所用激素為6-BA與NNA，試驗只對6-BA進行不同濃度處理。結果表明，6-BA濃度高低與污染率高低無關；隨6-BA濃度的增加，腋芽誘導分化率與苗的增殖數量芽增殖等相應提高。由于未設置太多的激素組合處理，試驗結果僅供參考。綜合污染率、芽分化、苗增殖等因素考慮，在開放式培養中6-BA濃度以1.5～2.0 mg/L較適宜。

植物開放式組織培養技術對環境無嚴格的無菌要求、操作程序簡化，成本降低，是未來植物組織培養發展的主要方向。試驗中添加的次氯酸鈉，雖然對組織培養過程中的微生物生長有較好的抑制作用，實現了開放式培養；但同時，次氯酸鈉對甘蔗組培苗的繁育也有抑制作用，與傳統培養方式相比，在培養基中添加抑菌劑繁育的甘蔗組培苗較弱。

綜上所述，在MS+BA 1.5～2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/ L+蔗糖30‰+次氯酸鈉1 000 mg/L的培養基中，腋芽繁殖速度較快，可在甘蔗開放式組織培養中使用；但腋芽增殖速度與組培苗素質仍低于對照。因此，篩選出既能抑菌又不影響外植體生長的抑菌劑是植物開放式組織培養技術的核心，也是開放式培養在生產中成功應用的前提。

［1］ 惲 綿. 我國甘蔗組織培養工廠化育苗技術的應用與展望［J］. 甘蔗糖業，1989，（2）：13-15.

［2］ 張 慎，郭陶然，鄧志瑞，等. 植物開放式組織培養的研究進展［J］.安徽農業科學，2010，38（26）：14281-14283，14288.

［3］ 吳桂容，曲芬霞，余炳鋒. 賀州荸薺開放式組織培養體系建立［J］.北方園藝，2013，（6）：110-112.

［4］ 王趙玉，張健雄，戶新宇，等. 抑菌劑在開放式植物組織培養中的應用研究［J］. 北方園藝，2012，（18）：125-127.

［5］ 黃泰達，莫廷輝. 香蕉開放式組織培養中增殖培養基成分優化研究［J］. 安徽農業科學，2012，40（18）：9584-9586.

［6］ 解 輝，莫廷輝，曾麗星. 次氯酸鈉在香蕉開放式組織培養中的應用研究［J］. 熱帶作物學報，2011，32（5）：886-890.

［7］ 趙青華，陳永波，滕建勛，等. 開放式組織培養下魔芋快繁技術研究［J］. 現代農業科技，2011，（13）：114-115.

［8］ 王 丹，劉 霞. 山梨酸鉀在紅豆杉開放式組織培養中的應用［J］.安徽農業科學，2010，38（2）：634-635.

［9］ 趙青華，陳永波，楊朝柱，等. 魔芋開放式組織培養技術初探［J］.氨基酸和生物資源，2009，31（4）：79-82.

［10］ 陳瑞丹，孫文薇. 梅花品種“淡豐后”莖段開放式啟動培養的初步研究［J］. 北京林業大學學報，2007，29（S1）：30-34.

［11］ 張薪薪，唐金花，王關林. 抑菌劑在開放組培中的使用及效果研究［J］. 遼寧師范大學學報（自然科學版），2005，28（4）：466-469.

（責任編輯：夏亞男）

Technology Research of Open Tissue Culture for Sugarcane Rapid Propagation

LI Song，LIU Hong-jiang，LIU Xin，LIU Jun-xian，YU Kun-xin，LU Man-man，LIU Li-m in，HE Yi-bo
（The Sugarcane Research Institute， GXAAS， Collaborative Innovation Center of Sugarcane Industry， Nanning 530007， PRC）

Under the condition of open tissue culture with 1000 mg/L sodium hypochlorite as bacteriostatic agent， the MS composition of inorganic salt， sucrose， hormone， etc. were tested by instigation of sugarcane axillary bud differentiation， proliferation， etc.. The results showed that： （1） pollution rate was not signif cant among concentrations of inorganic salt and the 6-BA and signif cant among sucrose concentrations with the increase of sucrose concentration. （2） The sugarcane axillary bud differentiation was affected by the concentration of inorganic salt， sucrose without regularity and increased with 6-BA concentration increased. （3） The shoot propagation increased with concentration increased of inorganic salts， 6-BA and sucrose. It was concluded that with medium of MS +1.5-2.0 mg/L BA + 0.1mg/L NAA + 30‰ sucrose +1 000 mg/L sodium hypochlorite， the axillary bud propagation was faster and can be used in the sugarcane open tissue culture. However， the proliferation rate and the shoot quality were lower than controls.

sugarcane； open tissue culture； rapid propagation

S566.1；Q943.1

A

1006-060X（2016）09-0001-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.09.001

2016-06-20

廣西自然科學基金項目（2014GXNSFAA118090）；廣西農業科學院科技發展基金項目（2015JZ06）

李 松（1964-），男，廣西博白縣人，研究員，研究方向：甘蔗生物技術、誘變育種與栽培。

可見，在MS+BA 1.5～2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30‰+次氯酸鈉1 000 mg/L的培養基中，腋芽繁殖速度較快，可在甘蔗開放式組織培養中使用；但腋芽增殖速度與組培苗素質仍低于對照。關鍵詞：甘蔗；開放式組培；快繁技術