復合成骨誘導劑對骨髓基質干細胞成骨分化的影響

甘升遠，夏德林，肖 鳴，邵學壘，吳雙江，張 磊

復合成骨誘導劑對骨髓基質干細胞成骨分化的影響

甘升遠，夏德林，肖 鳴，邵學壘，吳雙江，張 磊

（西南醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科四川 瀘州646000）

目的：探討復合成骨誘導劑對骨髓基質干細胞（Bone Marrow Stromal Stem Cells， BMSCs）成骨分化的影響。方法：選取2月齡SD雄性大鼠2只，處死后沖洗股骨，脛骨骨髓腔獲得骨髓組織，采用貼壁培養法純化大鼠BMSCs，并進行原代和傳代培養。取第三代BMSCs，將細胞分A～G 7個組，A組為對照組：在不含任何誘導劑的培養基內培養；B組為常規誘導組：在僅含有誘導劑（10.0mmol/β-甘油酸鈉，10-8mol/L地塞米松，50mg/L抗壞血酸）的培養基內培養；C，D，E，F，G組為復合誘導組，在含有復合誘導劑（常規誘導劑+阿侖膦酸鈉）的培養基內培養，其中阿侖膦酸鈉的濃度分別是10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L。觀察細胞貼壁生長增殖及形態變化，western-blot法檢測骨形態發生蛋白（BMP-2）的表達。結果：觀察發現各組細胞貼壁生長良好，呈長梭形，細胞均存活，E組細胞體積變得肥大，長出多個胞漿突起呈多角形，細胞周圍可見云霧狀分泌物。A組中細胞呈長梭形增殖，形態未見明顯變化，分泌物最少。各周各組western檢測發現BMP-2表達量順序均如下：10-8mol/L 組＞10-7mol/L組＞10-9mol/L組＞10-6mol/L組＞10-10mol/L組＞常規誘導組＞空白對照組。結論：阿侖膦酸鈉在低濃度（10-8mol/L）時對骨髓基質干細胞成骨分化具有促進作用。

阿侖膦酸鈉；骨髓基質干細胞；大鼠；成骨分化；

隨著組織工程骨的發展為修復骨組織缺損提供了新方法，多因素誘導骨組織的發生，而基因強化的組織工程程序復雜，實施困難，因此需尋找復合成骨誘導劑誘導骨組織的發生。雙膦酸鹽可以降低骨組織吸收，形成并維持骨質的結構和礦化程度，調節骨更新［1］。阿侖膦酸鈉屬于第三代含氮二膦酸鹽，是目前治療骨質疏松癥的常用藥物之一，其主要機制是抑制破骨細胞的骨吸收功能［2］。骨髓基質干細胞是存在于骨髓基質中的一種非造血干細胞，易于擴增且具有多潛能分化能力。骨髓基質干細胞是最先且最早的骨組織工程種子細胞。骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins， BMP）是BMSCs分泌的糖蛋白，可以促進骨的生長。目前BMP蛋白種類較多，其中比較具有代表性的是BMP-2，在BMSCs成骨分化的過程中能夠自分泌BMP-2，因此本實驗評估BMSCs的成骨分化是利用westernblot檢測BMP-2的表達來實現的。阿侖膦酸鈉對骨髓基質干細胞成骨分化是否具有作用尚不清楚。本實驗通過不同濃度阿侖膦酸鈉與傳統成骨誘導劑共同作用骨髓基質干細胞，觀察并探討其對骨髓基質干細胞成骨分化的影響。

1　材料和方法

1.1實驗動物及主要實驗試劑和儀器：2月齡雄性SD大鼠2 只，體重100 g（由西南醫科大學實驗動物中心提供）；FBS胎牛血清，L-DMEM低糖培養基（eHylone公司，美國）；0.25% 胰蛋白酶，地塞米松，維生素C，β-甘油磷酸鈉（Sigma 公司，美國）；阿侖膦酸鈉（杭州默沙東制藥有限公司）；青霉素-鏈霉素溶液、Hank’s液（碧云天生物科技有限公司）； Na2HPO3·12H2O、 NaH2PO3·2H2O（上海國藥）；倒置相差顯微鏡XSJ-D型（日本OLYMPUS光學儀器有限公司）；蛋白電泳儀（創博環球生物科技有限公司）；流式細胞儀（美國貝克曼公司）。

1.2BMSCs的采集、分離、培養和鑒定：取2月齡雄性SD大鼠2只，體重100g經脫頸處死后，予以75%酒精浸泡消毒10min；無菌操作下分離大鼠股骨、脛骨，去除雙側干骺端，以含有肝素的DMEM 5ml充分沖洗髓腔3次，沖洗液1 000r/min離心10min。取膜狀的有核細胞層（BMSCs層即包含在該層中）接種于培養瓶（含DMEM培養液，10%入胎牛血清）中培養，換液去除懸浮細胞。14d后貼壁細胞達約80%融合，即得到原代培養細胞。以0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養，每2d換液一次并在倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs形態生長變化。取活力旺盛的細胞，制備細胞懸液，調整細胞濃度為1×107/L。取細胞懸液2 000r/min離心10min，棄上清，分別加入抗CD44、CD45，混勻后室溫孵育30min，經PBS洗滌離心2次后，加入FITC標記的二抗避光反應15min，流式細胞儀檢測細胞CD44、CD45的表達情況［3-4］。

1.3不同濃度阿倫膦酸鈉的成骨誘導：取融合至80%第3代大鼠BMSCs，以0.25%胰蛋白酶消化離心后重懸，調整細胞密度至2×105/ml，接種于3塊 96孔板中，選取其中91孔分為七組（A～G）接種培養，接種細胞混懸液100μl。待細胞貼壁后向B、C、D、E、F、G組加入常規誘導劑，含有濃度為10-8mol/L地塞米松， 10mmol/L，β-甘油酸鈉，50mg/L抗壞血酸；A組不加入任何誘導劑，再往C、D、E、F、G組中加入不同濃度阿侖膦酸鈉溶液，從C-G組中分別為10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L。將3個96孔板分別標記為1，2，3板。1板培養7d，2板培養14d，3板培養21d。培養期間每2d換液一次。

1.4western-blot檢測BMP-2的表達：將每組細胞收集，加入PBS溶液清洗，加入細胞裂解液裂解細胞，離心提取上清液蛋白。每個樣品槽內加入5×SDS上樣緩沖液及等體積蛋白樣品，然后接通電源進行電泳。通過電轉印法將凝膠轉移至硝酸纖維素膜上。將轉印后的膜脫色置于一抗液面上室溫下孵育2h，再次脫色后將膜置于SuperSignal化學發光試劑中進行化學發光反應1h。使用Phoretix 1D軟件進行灰度值分析。

1.5統計學分析：采用SPSS 17.0軟件計算實驗數據，實驗所有參數均以xˉ±s表示。采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有顯著性意義。

2　結果

2.1BMSCs培養結果：原代培養的細胞在48～72h后，細胞貼壁，胞體圓形或多邊形。培養4d后，細胞體積增大，胞體呈梭形，伴長突起，胞核大，扁圓形（圖1）。在7d左右，細胞相互融合，成片生長。細胞達80%貼壁融合時胰酶消化傳代。傳代后細胞形態更均勻，呈長梭形（圖2）。流式細胞儀檢測結果顯示，培養的細胞CD44表達陽性，而CD45表達呈陰性（圖3、4），表示培養的細胞是BMSCs。

2.2BMP-2的表達：使用Phoretix 1D軟件進行灰度值分析各組組中BMP-2均有表達，在第7天時各組BMP-2出現表達量出現明顯差異（圖5）；第14天表達量差異較第7天更加明顯（圖6）；第21天時表達差異達到最高（圖7）。各周各組western檢測發現BMP-2表達量順序均如下：10-8mol/L組＞10-7mol/L組＞10-9mol/L組＞10-6mol/L組＞10-10mol/L組＞常規誘導組＞空白對照組。常規誘導劑與其他濃度阿侖膦酸鈉共同作用時BMP-2表達量均不及10-8mol/L組。B組單一使用常規誘導劑其BMP-2表達量較C、D、E、F、G組最低。實驗組與對照相比，其表達存在明顯差異（P＜0.05），具有統計學意義。用Phoretix 1D軟件讀取各條帶灰度值，比值及標準差如表1所示。

圖1　原代骨髓基質干細胞（倒置相差顯微鏡下拍攝，×200)

　　圖2 第3代骨髓基質干細胞（倒置相差顯微鏡下拍攝，×200）

圖3　CD44表達結果

圖4　CD45表達結果

圖5　第7天Western-blot圖

圖7　第21天Western-blot圖

表1　各組第7、14、21天Western-blot檢測BMP-2的蛋白表達

3　討論

BMSCs是骨髓基質中的多能干細胞，經體外誘導培養可以成骨，成纖維，成軟骨，成脂肪，成肌肉等細胞方向分化［5］。骨髓基質干細胞中加入成骨誘導劑可以明顯誘導其成骨分化［6］。誘導BMSCs向成骨細胞轉化需要特定的外界環境，經典成骨誘導劑（地塞米松，甘油酸鈉，維生素C）作用溫和，成本較低，能增強堿性磷酸酶活性，誘導細胞產生骨鈣素，從而誘導BMSCs向成骨細胞向分化。由于經典的成骨誘導劑誘導效率較低不能滿足臨床構建大塊組織工程骨的需要［7-8］。如何提高BMSCs成骨分化的能力，滿足構建大塊骨組織工程骨解決臨床治療所需，是目前骨組織工程研究的難點之一。

雙膦酸鹽作為治療骨質疏松的首選藥物，減少骨吸收改建治療骨質疏松癥。阿侖膦酸鈉第三代雙膦酸鹽典型代表，能抑制破骨細胞生長，促進使其發生程序性細胞凋亡，同時還能促進成骨細胞的增殖和成熟，從而抑制骨的吸收，維持骨質密度。如Mathov阿侖膦酸鹽誘導了大鼠顱蓋骨源性成骨細胞的增殖［9］促進人松質骨成骨細胞數的增加，增強堿性磷酸酶（alkaline phosphataseALP）活性及BMP-2、I型膠原和骨鈣素的表達。Fu LJ等研究表明阿侖膦酸鈉不僅可誘導BMSCs成骨向分化還抑制BMSCs的成脂向分化［10］。董群偉等［11］研究不同濃度阿侖膦酸鈉對BMSCs成骨向分化能力的影響，發現10-8mol/L阿侖膦酸鈉組增殖速度（0.366±0.012）明顯大于對照組（0.184±0.031）。因此，一定濃度的阿侖膦酸鈉可作為一種成骨誘導劑來促進BMSCs向成骨細胞分化。

本實驗將不同濃度的阿侖膦酸鈉與成骨誘導劑（10-8mol/L地塞米松，10.0mmol/β-甘油酸鈉，50mg/L維生素C）混合后加入培養基共同培養BMSCs，與單一的經典誘導劑進行比較，并觀察阿侖膦酸鈉誘導BMSCs成骨分化的作用。采用貼壁法結合密度梯度離心法分離培養BMSCs，經檢測細胞CD44、CD45的表達，成功分離純化傳代BMSCs，同時不影響細胞的干細胞特性。實驗結果顯示：第7天時成骨誘導培養所有組中BMP-2均有不同程度的表達，在第14天表達量的差異明顯；21d時差異達到最高。10-8mol/LALN+常規誘導劑共同作用于BMSCs時BMP-2的表達水平最高。其他濃度ALN+常規誘導劑組表達明顯減弱，但是混合后對BMSCs的誘導作用也明顯高于空白對照組的誘導作用。無任何誘導劑組，其表達劑量最低。表明阿侖膦酸鈉和常規骨誘導劑能促進BMSCs向成骨細胞轉化，提高轉化效率，且阿侖膦酸鈉在10-8mol/L濃度的時與常規誘導劑誘導BMSCs成骨轉化作用最強。

綜上所述，本實驗研究表明復合骨誘導劑能促進BMSCs向成骨細胞的轉化，提高轉化效率。通過改良種子細胞為構建大塊骨組織功提供一種新的方法。

［1］Fermtfi G，Fabi A，Carlini P，et al. Zoledronic acid-induced circulating level modifications of angiogenic fact，metalloproteises and proinflammatory cytokines in metastatic breast cancer patients［J］. Oncology，2005，69（1）:35-43.

［2］Allen MR. The effects of bisphosphonates on jaw bone remodeling，tissue properties，and extraction healing［J］.Odontology，2011，99（1）: 8-17.

［3］夏德林，劉道華，賈娟，等.兔骨髓基質干細胞體外分離培養及生物學特性研究［J］.中國美容醫學，2011，20（8）:1251-1254.

［4］夏德林，黃銘柯，付光新，等.Triton X-100對脂質體介導的BMP-2基因轉染大鼠BMSCs的作用［J］.中國修復重建外科雜志，2015，29（1）:69-73.

［5］Saito F，Nakatani T，Iwase M，et al. Administration of cul-tured autologous bone marrow stromal cells into cereb-rospinal fluid in spinal injury patients: a pilot study［J］.Restor Neurol Neurosci，2012，30（2）: 127-136.

［6］Muschler GF，Raut VP.The Design and Use of Animal Models for Translational Research in Bone Tissue Engineering and Regenerative Medicine［J］.Tissue Engineering Part B Rev，2010，16（1）:123-145.

［7］王艷雙.大鼠骨髓基質干細胞分離培養及向成骨、成脂誘導分化的研究［J］.北華大學學報（自然科學版），2015，16（6）:748-752.

［8］魏強強，殷嫦嫦，殷明，等.GDF-5聯合地塞米松誘導大鼠BMSCs向類髓核樣細胞分化［J］.基礎醫學與臨床，2014，34（8）:1037-1043.

［9］Mathov I，Plotkin LI，Sgarlata CL，et al.Extracellular signal-regulated kinases and calcium channels are involved in the proliferative effect of bisphosphonates on osteoblastic cells in vitro［J］.J Bone Miner Res，2001，16（11）:2050-2056.

［10］Fu LJ，Tang TT，Miao YY.Stimulation of osteogenic differentiation and inhibition of adipogenic differentiation in bone marrow stromalcells by alendronate via ERK and JNK activation［J］. Bone，2008，43（1） :40-47.

［11］董群偉，孫奮勇，洪曼杰，等.阿侖膦酸鈉對體外培養的間充質干細胞成骨能力的影響［J］.廣東醫學，2006，4（27）: 462-464.

編輯/張惠娟

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本刊編輯部

Experimental study on composite osteogenic inducer promoted rat bone marrow stromal cells to differentiate into osteoblast in vitro

GAN Sheng-yuan， XIA De-lin， XIAO Ming， SHAO Xue-lei，WU Shuang-jiang， ZHANG Lei
（Department of Oral and Maxillofacial Surgery， Affiliated Stomatological Hospital， Southwest Medical University， Luzhou 646000， Sichuan，China）

ObjectiveTo investigate the effect of compound osteogenic inducer on ost-eogenic differentiation of bone marrow stromal cells.MethodsThe BMSCs were isolated by gradient centrifugation with adherent culture from Sprague Dawley rats of two months old. The third generation of bone marrow stromal stem cells with 1×108/L concentration was divided into seven groups with A to G. The group A was blank group， which cultured in L-DMEM with 10% FBS. The group B was Conventional induction group， which cultured in L-DMEM with 10-8mol/L dexamethasone， 10.0 mmol/l β- glycerin， sodium and 50mg / L ascorbic acid. The group C to G was Compound induced group which cultured the cultured in the same concentration osteoblast-induced fluid the same as group B. Then the group C to G was separately added with 10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L，10-10mol/ L ALN. Changes of proliferation and morphology of cells were observed under inverted microscope. The expression of the BMP-2 was tested by western-blot. The test was used for statistical analysis.ResultsThe cells of every group were survived and live well. The cells become hypertrophy， multi angle， and the high secretory activity in the E group than other groups. The number of cells in the A group change at least， the lowest secreti-on obviously. The order of the result of the expression of BMP-2 was 10-8mol/L group＞10-7mol/L group＞10-9mol/L group＞10-6mol/L group＞10-10mol/L group＞Conventional induction group＞blank group.ConclusionAllen alendronate at low concentration （10-8mol/L） can promote osteogenic differentiation on bone marrow stromal cells.

alendronate； bone marrow stromal cells；rat； osteogenetic differentiation

Q813.1

A

1008-6455（2016）09-0074-04

2016-05-27

2016-08-29

夏德林，男，四川瀘州人，西南醫科大學附屬口腔醫院頜面外科主任，碩士研究生導師，教授，主要從事顱頜面畸形整復與重建，頜面部腫瘤治療；E-mail：xiadeln@163.com

甘升遠，男，四川省宜賓市人，西南醫科大學口腔頜面外科在讀碩士；E-mail：414737415@qq.com