毛囊細(xì)胞移植治療禿發(fā)疾病的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)研究

陳明娟，王原路，侯 剛

·基礎(chǔ)研究·

毛囊細(xì)胞移植治療禿發(fā)疾病的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)研究

陳明娟1，王原路1，侯 剛2

（1.廣州市第一人民醫(yī)院整形外科廣東 廣州510180；2.中山大學(xué)附屬嶺南醫(yī)院骨科廣東 廣州510515）

目的：探索細(xì)胞移植誘導(dǎo)毛發(fā)再生模式，為毛囊細(xì)胞移植奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：利用酶消化法分離培養(yǎng)綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因鼠的表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞，分別進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增至第三代后注射移植入裸鼠皮下，觀察其毛囊誘導(dǎo)能力。結(jié)果：表皮細(xì)胞移植無(wú)法誘導(dǎo)毛囊發(fā)育；真皮細(xì)胞移植僅誘導(dǎo)形成毛囊樣結(jié)構(gòu)；混合細(xì)胞移植能夠誘導(dǎo)毛囊及毛干發(fā)育。結(jié)論：混合細(xì)胞培養(yǎng)可作為毛囊細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，為毛囊細(xì)胞移植提供良好供體。

真皮細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；毛囊；誘導(dǎo)；細(xì)胞移植

全球脫發(fā)治療新進(jìn)展研討會(huì)曾公布調(diào)查結(jié)果顯示：世界上大約有50%成年男性受到脫發(fā)困擾，脫發(fā)現(xiàn)象遍及世界各個(gè)地區(qū)各個(gè)民族。然而目前的治療方法無(wú)法從根本上解決脫發(fā)這一難題，因此細(xì)胞移植誘導(dǎo)毛囊再生成為近年來(lái)研究的重點(diǎn)。已證實(shí)的同毛囊再生具有密切關(guān)系的細(xì)胞包括毛乳頭細(xì)胞（Dermal papilla cells，DPCs）和毛囊干細(xì)胞（hair follicle stem cells，HFSCs），并能夠進(jìn)行體外擴(kuò)增，為細(xì)胞移植提供大量的種子細(xì)胞。但是通過(guò)何種培養(yǎng)方式，能夠獲得大量具有毛囊誘導(dǎo)能力的種子細(xì)胞成為毛囊再生的首要問(wèn)題。因此，本研究我們將探索細(xì)胞培養(yǎng)模式對(duì)毛囊發(fā)育的影響，最終確立一種科學(xué)的培養(yǎng)模型進(jìn)行體外培養(yǎng)，從而為毛囊的正常發(fā)育提供穩(wěn)定的環(huán)境，為毛囊組織工程重建和毛發(fā)移植的臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑：4～6周齡裸鼠，綠色熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)基因小鼠各一只，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。I型膠原酶、中性蛋白酶、胰酶（GIBCO公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（SIGMA公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基，青、鏈霉素（杭州吉諾公司）；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF-2（SIGMA公司）；CD34、CD44、CD133（bs-0395R，BIOS公司）。

1.2種子細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：取生后第1天的GFP轉(zhuǎn)基因鼠1只，取其背部皮膚約0.5cm×0.5cm組織塊，用0.1%中性蛋白酶4℃消化過(guò)夜。PBS（含1%青、鏈霉素）漂洗3次，用顯微鑷將表皮和真皮分離。分別剪碎，表皮用0.25%胰酶37℃消化10min，真皮以0.2%膠原酶37℃孵育約30min，直至所有組織被消化。加入DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）終止消化。200目篩網(wǎng)過(guò)濾，去除組織碎片和細(xì)胞團(tuán)塊，收集單細(xì)胞混懸液于離心管離心（1 000r/min）5min，重復(fù)離心2次，棄上清液，加入DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）。分別取表皮細(xì)胞懸液、真皮細(xì)胞懸液各1.5ml接種至25ml培養(yǎng)瓶中，加入2ml培養(yǎng)基，50g/L FGF-2，置于孵箱中，24h換液。待細(xì)胞貼壁后每3d換液1次，按1:2比例傳至第三代。分別收集表皮細(xì)胞懸液、真皮細(xì)胞懸液以及表皮、真皮按1:2比例混合細(xì)胞懸液。

1.3流式細(xì)胞檢測(cè)分析：將臺(tái)盼藍(lán)染色＞95%活力的表皮、真皮混合細(xì)胞以106/孔種于12孔板，0.25%胰蛋白酶收集細(xì)胞。重懸于含有1:50稀釋的FITC-CD34和FITC-CD44抗體或1:20稀釋的FITC-CD133抗體（以1:50稀釋的mouse IgG/ FITC作為對(duì)照），37℃，30min。流式細(xì)胞儀激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488nm； 發(fā)射波長(zhǎng)Em=530nm。檢測(cè)陽(yáng)性率。

1.4細(xì)胞體內(nèi)移植：裸鼠用戊巴比妥鈉麻醉，用1ml注射器將第三代細(xì)胞懸液分別注射移植至裸鼠背部皮下，注射后定期（2、4、8周）大體觀察毛發(fā)發(fā)育情況。于第8周取移植部位組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，熒光顯微鏡下觀察。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：表皮細(xì)胞無(wú)法貼壁培養(yǎng)，真皮細(xì)胞及混合細(xì)胞接種后24h內(nèi)貼壁。熒光顯微鏡下觀察最初為小圓形，細(xì)胞大小不均勻（圖1）。24h后逐漸伸展為梭形，4d 后形態(tài)呈成纖維細(xì)胞樣，核呈橢圓形較大（圖2）。原代培養(yǎng)的細(xì)胞7d 即達(dá)70%～80% 融合。細(xì)胞隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞體積逐漸增大。

圖1　熒光顯微鏡下觀察真皮細(xì)胞懸液（×10）

圖2　真皮細(xì)胞接種24h后熒光顯微鏡下觀察（×100）

2.2流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示：細(xì)胞流式分析陽(yáng)性細(xì)胞百分比CD34（52.6%）；CD44（40.67%）；CD133（48.1%）；IgG（70.7%） （圖3）。

圖3　陽(yáng)性細(xì)胞百分比　CD34（52.6%）； CD44（40.67%）； CD133（48.1%）；lgG（70.7%）

2.3細(xì)胞移植后觀察：移植后2周，單純表皮細(xì)胞受區(qū)未見(jiàn)明顯變化，真皮細(xì)胞及混合細(xì)胞受區(qū)可見(jiàn)組織增厚，逐漸呈現(xiàn)輕微的隆起。移植后8周，取受區(qū)部位的皮膚行組織切片并染色，光鏡下可見(jiàn)真皮細(xì)胞及混合細(xì)胞受區(qū)有大量呈同心圓排列的毛囊結(jié)構(gòu)，其中心為嗜伊紅染色的角化物質(zhì)，向外依次為內(nèi)根鞘、外根鞘、真皮鞘（圖4）。混合細(xì)胞受區(qū)熒光顯微鏡下毛發(fā)發(fā)育清晰可見(jiàn)（圖5），體視顯微鏡下可觀察的到大量的毛囊、毛干形成（圖6）。表皮細(xì)胞受區(qū)組織未見(jiàn)毛囊結(jié)構(gòu)。

圖4　顯微鏡下觀察真皮細(xì)胞移植后2周受區(qū)的毛囊結(jié)構(gòu)（HE×60）

圖5　熒光顯微鏡下觀察混合細(xì)胞移植后2周毛發(fā)發(fā)育情況（×5）

圖6　皮下移植兩周后有毛發(fā)纖維形成（×5）

3　討論

對(duì)于哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)，毛囊是一個(gè)特殊的器官，它由真皮和表皮成分組成。一個(gè)毛囊包括同心圓的上皮鞘（毛干，內(nèi)根鞘，外根鞘），被同毛囊底部真皮乳頭相連的真皮鞘圍繞［1］。在外根鞘中間膨大部位稱為膨出部有表皮干細(xì)胞的聚集。這些干細(xì)胞同毛囊底部的真皮乳頭相互作用發(fā)育為不同類型的毛囊細(xì)胞［2］。毛發(fā)的發(fā)生最早始于胚胎期［3］。上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用使表皮細(xì)胞增厚并形成基板，從而表皮下間充質(zhì)細(xì)胞聚集成真皮濃集，最終發(fā)育為真皮乳頭，即毛乳頭［4］。DPCs和表皮細(xì)胞作為毛囊的兩種主要成分通過(guò)相互的交流最終發(fā)育形成毛囊［5］。毛囊中的三種細(xì)胞成分，即外根鞘細(xì)胞、DPCs和真皮鞘細(xì)胞。其中真皮鞘細(xì)胞和DPCs 是主要的真皮源性細(xì)胞［6］，而外根鞘細(xì)胞則為表皮源性細(xì)胞［7］。

研究表明，CD34、CD133、CD44都是正常組織幼稚細(xì)胞的標(biāo)志物。CD34分子是高度糖基化的I型跨膜糖蛋白，選擇性地表達(dá)于人類及其他哺乳動(dòng)物造血干/祖細(xì)胞表面，并隨細(xì)胞的成熟逐漸減弱至消失，它是鼠毛囊干細(xì)胞中較好的表面標(biāo)志。CDl33是在人類造血干/祖細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的一種跨膜糖蛋白，最初被認(rèn)定為是造血干細(xì)胞的特異性標(biāo)志，但后來(lái)發(fā)現(xiàn)CDl33蛋白在神經(jīng)干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞等多種干/祖細(xì)胞中都有表達(dá)。Yuriko等研究證實(shí)，CD133同毛囊細(xì)胞誘導(dǎo)能力有關(guān)，可作為一種新的細(xì)胞表面標(biāo)記來(lái)檢測(cè)和分離具有毛囊誘導(dǎo)能力的真皮乳頭細(xì)胞（DPCs）。CD44是種細(xì)胞粘附分子，已知其為分布極為廣泛的細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，主要參與異質(zhì)性粘附，代表了細(xì)胞的聚集性生長(zhǎng)能力。因此，本實(shí)驗(yàn)以CD34、CD44、CD133為標(biāo)記來(lái)鑒定所獲得的種子細(xì)胞的干細(xì)胞特性及其毛囊誘導(dǎo)能力。

本實(shí)驗(yàn)取材于新生GFP轉(zhuǎn)基因鼠的皮膚組織，經(jīng)過(guò)酶的消化最終得到表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞，其中包括大量的毛囊細(xì)胞及其前體。真皮細(xì)胞類似成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，且能夠貼壁生長(zhǎng)，符合真皮乳頭細(xì)胞的特性。此外，我們將分離出的真皮細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞檢測(cè)分析細(xì)胞表達(dá)CD34、CD44、CD133，其中CD34代表了所得細(xì)胞的干細(xì)胞特性，CD133說(shuō)明細(xì)胞具有毛囊誘導(dǎo)能力，CD44則代表該細(xì)胞具有聚集性生長(zhǎng)能力。檢測(cè)結(jié)果表明所獲得的細(xì)胞具有較強(qiáng)的毛囊誘導(dǎo)能力，可作為毛囊種子細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（FGF2）能夠有力促進(jìn)成纖維細(xì)胞有絲分裂， 最新的實(shí)驗(yàn)表明，毛乳頭細(xì)胞在含有成纖維生長(zhǎng)因子-2（FGF2）的培養(yǎng)基中，其誘導(dǎo)能力可以長(zhǎng)期維持，而且當(dāng)分散的毛乳頭細(xì)胞聚集成球后其喪失的誘導(dǎo)能力可以恢復(fù)［8-10］，因此在體外培養(yǎng)擴(kuò)增時(shí)加入FGF-2有利于細(xì)胞誘導(dǎo)毛囊再生能力的維持。本實(shí)驗(yàn)利用第三代細(xì)胞制備表皮細(xì)胞懸液、真皮細(xì)胞懸液以及1:2混合細(xì)胞懸液進(jìn)行裸鼠皮下移植，2周便可觀察到毛囊的形成，這充分顯示通過(guò)培養(yǎng)的細(xì)胞具有毛發(fā)誘導(dǎo)能力，但混合細(xì)胞移植能夠發(fā)育為毛干，提示我們表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞之間存在著某種特定的信號(hào)調(diào)節(jié)通路，兩者相互作用才能發(fā)育為完整的毛發(fā)組織［11］。筆者之所以采用GFP轉(zhuǎn)基因鼠，是因?yàn)槠湓跓晒怙@微鏡下更容易觀察形成毛囊的細(xì)胞來(lái)源，發(fā)育形成的毛囊、毛干均呈綠色熒光表達(dá)則可以證明是由注射的細(xì)胞所形成。

本實(shí)驗(yàn)雖然證實(shí)體外培養(yǎng)擴(kuò)增的毛囊細(xì)胞能夠誘導(dǎo)毛發(fā)再生，但其誘導(dǎo)特性能夠維持多久仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。盡管目前針對(duì)毛囊細(xì)胞的研究進(jìn)展迅速，但對(duì)于毛囊的再生仍有許多問(wèn)題亟待進(jìn)一步的闡明，探索毛囊細(xì)胞間的聯(lián)合培養(yǎng)模式及移植方式，為細(xì)胞療法來(lái)解決禿發(fā)這一難題提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Experimental research of hair follicle cell transplantation for treatment of bald disease

CHEN Ming-juan1， WANG Yuan-lu1， HOU Gang2
（Department of Plastic Sugery， Guangzhou First People＇s Hospital，Guangzhou 510180，Guangdong，China）

ObjectiveExploring the mode of cell transplantation to inducing hair regeneration， for the experimental basis for the hair follicle cells transplantation.MethodsCultivate epidermal cells and dermal cells of green fluorescent protein transgenic mice by enzyme digestion method， then amplify in vitro respectively to the third generation. After that， transplant the cells in nude mice by subcutaneously injecting， observe the hair follicle induction ability.ResultsEpidermal cells transplantation could not induce hair follicle development； Dermal cells transplantation only induce formation of hair follicle structure. Mixed cells transplantation can induce the hair follicle and hair shaft.ConclusionMixed cells culture can be used as hair follicle cells in vitro culture model， that providing a good donor for hair follicle cells transplantation.

dermal cell ；cell culture； hair follicle；inducibility；cells transplantation

R322

A

1008-6455（2016）09-0071-03

2016-06-27

2016-09-05

編輯/張惠娟

毛囊細(xì)胞移植治療禿發(fā)疾病的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)研究（2012B031800011）

王原路（1963-），男，主任醫(yī)師，碩士研究生；主要研究方向?yàn)槊娌空蚊廊萃饪疲籈-mail:115415129@qq.com