復(fù)治肺結(jié)核患者痰液耐藥結(jié)核分枝桿菌鑒定中熒光定量PCR與反向點(diǎn)雜交技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用

牛家峰，尚永明，張寧，劉義慶，張炳昌

(1淄博市第一醫(yī)院，山東淄博255200；2山東省立醫(yī)院)

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復(fù)治肺結(jié)核患者痰液耐藥結(jié)核分枝桿菌鑒定中熒光定量PCR與反向點(diǎn)雜交技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用

牛家峰1，尚永明1，張寧1，劉義慶2，張炳昌2

(1淄博市第一醫(yī)院，山東淄博255200；2山東省立醫(yī)院)

目的探討熒光定量PCR聯(lián)合反向點(diǎn)雜交技術(shù)在復(fù)治肺結(jié)核患者痰標(biāo)本耐藥結(jié)核分枝桿菌鑒定中的應(yīng)用價值。方法 收集247例復(fù)治肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本，采用熒光定量PCR法檢測結(jié)核分枝桿菌DNA，采用反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因，以結(jié)核分支桿菌分離培養(yǎng)結(jié)果和抗結(jié)核藥敏試驗結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析評價。結(jié)果 247例復(fù)治肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中，抗酸桿菌涂片鏡檢、結(jié)核分支桿菌分離培養(yǎng)和PCR對結(jié)核分枝桿菌的檢出率分別為36.03%、45.55%和55.07%，PCR與抗酸桿菌涂片鏡檢對結(jié)核分枝桿菌的檢出率相比，P<0.05；以結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，PCR檢出結(jié)核分枝桿菌的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值陰性預(yù)測值分別為89.79%、72.88%、73.33%、89.58%，抗酸桿菌涂片鏡檢的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值陰性預(yù)測值分別為69.38%、91.52%、87.18%、78.26%。以藥敏試驗結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，反向點(diǎn)雜交技術(shù)對利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥基因的檢出率分別為55.91%、49.46%、47.31%、31.18%。結(jié)論 聯(lián)合應(yīng)用熒光定量PCR與反向點(diǎn)雜交技術(shù)可快速、有效鑒定出復(fù)治肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中的耐藥結(jié)核分枝桿菌。

肺結(jié)核；結(jié)核分枝桿菌；耐藥性；聚合酶鏈反應(yīng)；反向點(diǎn)雜交技術(shù);分子診斷技術(shù)

我國目前仍是結(jié)核病流行嚴(yán)重的國家，且細(xì)菌耐藥率較高。目前肺結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)化療方案由異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和鏈霉素5種一線抗結(jié)核藥物組成，規(guī)范的四聯(lián)標(biāo)準(zhǔn)化療方案可使初治結(jié)核治愈率達(dá)到90%，但由于患者依從性差、用藥不規(guī)范等原因，部分患者初治失敗或治愈后復(fù)發(fā)[1～3]。現(xiàn)行的復(fù)治肺結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)治療方案僅在初治方案基礎(chǔ)上對療程和用藥種類做統(tǒng)一調(diào)整，并未考慮到個體間耐藥譜差異，導(dǎo)致療效差異很大[4～6]，因此需要快速鑒定出耐藥菌株，保護(hù)易感人群并及早制定個性化治療方案[7～9]。WHO推薦使用分子生物學(xué)手段快速檢測耐藥突變，但單一實驗檢測效能并不高[1,9,10]。我們收集了部分復(fù)治結(jié)核病患者痰標(biāo)本，分析熒光定量PCR聯(lián)合反向點(diǎn)雜交技術(shù)在復(fù)治肺結(jié)核患者痰標(biāo)本耐藥結(jié)核分枝桿菌鑒定中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報告如下。

1　資料與方法

1.1 臨床資料2014年1月～2015年11月淄博市第一醫(yī)院結(jié)核科收治的復(fù)治肺結(jié)核患者247例，其中男158例、女89例，年齡18～85歲。復(fù)治肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]：①初治失敗的患者；②規(guī)則用藥滿療程后痰菌又復(fù)陽的患者；③不規(guī)律化療超過1個月的患者；④慢性排菌患者。其中標(biāo)準(zhǔn)化療方案初治失敗者95例，治愈后復(fù)發(fā)者81例，不規(guī)則化療超過1個月者58例，多次治療失敗慢性排菌者13例。

1.2痰標(biāo)本采集患者清晨以清水漱口清潔口腔后，深呼吸咳出痰液3～5 mL以無菌螺旋蓋痰瓶收集。痰量過少時，可收集當(dāng)天晚上至次日早晨的痰液。痰標(biāo)本應(yīng)為膿樣、干酪樣或膿性黏液樣性質(zhì)，痰樣中含有血液或其他雜質(zhì)的為不合格樣本，應(yīng)重新取樣。

1.3熒光定量PCR法檢測結(jié)核分枝桿菌DNA痰中加入2倍體積的4% NaOH，渦漩振蕩器振蕩液化。離心取沉淀，1 mL蒸餾水清洗沉淀離心，加DNA提取液50 μL，震蕩混勻，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，上清液作為DNA模板。取模板DNA 2 μL，加入結(jié)核分枝桿菌核酸熒光定量PCR檢測試劑，PCR反應(yīng)條件：93 ℃、2 min預(yù)變性，93 ℃、45 s變性，55 ℃、60 s退火、延伸，共40個循環(huán)。核酸定量結(jié)果達(dá)到最低檢出限(1×104copies/mL)，取模板DNA 4 μL，加入結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因檢測試劑盒PCR試劑，擴(kuò)增條件：95 ℃、10 min預(yù)變性，95 ℃、45 s變性，54 ℃、30 s退火，68 ℃、60 s延伸，60個循環(huán)，68 ℃、5 min總延伸，以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為反向點(diǎn)雜交底物。

1.4核酸反向點(diǎn)雜交法檢測抗結(jié)核藥物耐藥基因參照試劑盒說明書配置緩沖液，取膜條放入15 mL離心管中，加入雜交緩沖液5 mL及對應(yīng)PCR產(chǎn)物，沸水浴10 min，59 ℃雜交箱中搖浴雜交1.5 h，59 ℃預(yù)熱洗液搖浴洗滌15 min，膜條轉(zhuǎn)移至POD孵育液室溫?fù)u育30 min，雜交緩沖液搖洗兩次，每次5 min。膜條浸泡于新鮮配制的顯色液中，避光顯色5 min，出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)即待檢基因陽性。基因高頻突變位點(diǎn)：利福平作用基因rpoB基因531位TCG→TTG、TGG，526位CAC→TAC、GAC，516位GAC→GTC、GGC；異煙肼作用基因katG基因3l5位點(diǎn)AGC→ACC、AAC，inhA基因-15位點(diǎn)；鏈霉素作用基因rpsL基因43位AAG→AGG，88位AAG→AGG、ACG；乙胺丁醇作用基因ATG→CTG、TTG、GTG、ATC、ATT、ATA。

1.5抗酸桿菌涂片鏡檢、結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)及抗結(jié)核藥敏試驗所有實驗操作按照中國防癆協(xié)會2015版《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》要求進(jìn)行。結(jié)核菌分離培養(yǎng)陽性應(yīng)用比例法進(jìn)行藥物敏感性試驗，取菌落制備10-2、10-4mg/L的菌懸液，均勻接種至對照及含藥培養(yǎng)基表面(培養(yǎng)基含利福平40 mg/L、異煙肼0.2 mg/L、鏈霉素4 mg/L、乙胺丁醇2 mg/L)，37 ℃培養(yǎng)28 d后觀察結(jié)果。含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)/對照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)>1%判定為受試菌對該抗結(jié)核藥物耐藥。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS15.0軟件進(jìn)行處理。構(gòu)成比、率的比較采用χ2檢驗P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

247例復(fù)治肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中，抗酸桿菌涂片鏡檢、結(jié)核分支桿菌分離培養(yǎng)和PCR分別檢出結(jié)核分枝桿菌89(36.03%)、118(45.55%)和136(55.07%)例，PCR與抗酸桿菌涂片鏡檢對結(jié)核分枝桿菌的檢出率相比，P<0.05。以細(xì)菌培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，PCR檢出結(jié)核分枝桿菌的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為89.79%、72.88%、73.33%、89.58%，抗酸桿菌涂片鏡檢的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為69.38%、91.52%、87.18%、78.26%。

以藥敏試驗結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分析93例反向點(diǎn)雜交試驗數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥基因檢出率分別為55.91%、49.46%、47.31%、31.18%。詳見表1。

表1　反向點(diǎn)雜交法對復(fù)治肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的檢測效能

3　討論

全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，復(fù)治肺結(jié)核患者結(jié)核分枝桿菌對一線抗結(jié)核藥物利福平、異煙肼、乙胺丁醇、和鏈霉素中的任一藥物耐藥率高達(dá)35.9%[2]。目前山東省復(fù)治肺結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌耐藥率(20.9%)低于全國平均水平，但與初治患者耐藥率相近(19.0%)，兩者出現(xiàn)同步變化，形勢依然嚴(yán)峻[12，13]。《WHO耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南》認(rèn)為抗酸桿菌涂片鏡檢對結(jié)核分枝桿菌的檢出率低，且結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，復(fù)治患者耐藥菌株易漏檢。因此，WHO推薦以分子生物學(xué)檢測技術(shù)彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測手段的不足，正確判斷排菌、快速發(fā)現(xiàn)耐藥菌[1]。

目前可用于結(jié)核分枝桿菌檢測的分子檢測手段繁多，優(yōu)勢各有不同，而且其有效性多通過臨床分離株進(jìn)行驗證[14～19]。由于WHO建議快速檢測時限為2 d[1]，因此有必要組合多種技術(shù)手段優(yōu)勢形成檢測途徑，直接對痰液等原始標(biāo)本進(jìn)行檢測，并對分子檢測途徑的有效性進(jìn)行綜合分析探討。我們以熒光定量PCR法檢測復(fù)治患者痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌DNA，定性判斷排菌同時評估排菌量，再以反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因，此檢測途徑耗時6～8 h，臨床醫(yī)生可當(dāng)日獲得利福平rpoB基因、異煙肼katG基因和inhA基因、鏈霉素rpsL基因、乙胺丁醇embB基因的主要耐藥基因位點(diǎn)表達(dá)情況，據(jù)此給患者初步制定復(fù)治化療方案和預(yù)防措施。而與之同步進(jìn)行的結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)需要6～8周時間，進(jìn)行藥敏試驗則再延長2～4周時間[7]，顯然分子檢測途徑能有效縮短檢測時長，避免診斷延遲。

對于復(fù)治肺結(jié)核患者，既往已經(jīng)確診感染，檢測重點(diǎn)在于評估藥物治療效果，因此需要快速定性檢測具有較高的陰性預(yù)測值以確定停止排菌、治療有效，以及較高的敏感性有利于發(fā)現(xiàn)排菌、減少漏檢率[20]。本研究247例復(fù)治肺結(jié)核病患者的痰標(biāo)本中，PCR法的檢出率(55.07%)高于痰涂片(36.03%)，與分離培養(yǎng)檢出率(45.55%)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。分析痰涂片與PCR定性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCR檢出結(jié)核分枝桿菌的敏感性(89.79%)與陰性預(yù)測值(89.58%)較高，顯然以痰涂片檢菌評估患者對的藥物反應(yīng)，其陽性檢出率過低，對于復(fù)治患者漏檢風(fēng)險較大，而PCR法更適用于復(fù)治患者的快速篩選，且連續(xù)檢測痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌DNA含量也有利于監(jiān)測患者排菌量。考慮到反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測極限為1×104copies/mL，即并非所有結(jié)核分枝桿菌DNA陽性標(biāo)本均能用于雜交實驗，為保證耐藥相關(guān)基因高頻突變位點(diǎn)檢測的有效性，有必要在PCR定性檢測基礎(chǔ)上，增加定量檢測，避免醫(yī)療資源浪費(fèi)。

我們以藥敏試驗為金標(biāo)準(zhǔn)評估反向點(diǎn)雜交技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測中的價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌對4種一線抗結(jié)核藥物的耐藥基因檢出率由高到低依次為利福平耐藥基因(55.91%)、異煙肼耐藥基因(49.46%)、鏈霉素耐藥基因(47.31%)、乙胺丁醇耐藥基因(31.18%)，與藥敏試驗結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異，說明痰標(biāo)本反向點(diǎn)雜交檢測可快速有效檢出耐藥基因，在制定個體化復(fù)治方案同時，可早期采取有效措施保護(hù)易感人群。

我們分析反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測不同藥物耐藥基因的敏感度、特異度、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值，發(fā)現(xiàn)反向點(diǎn)雜交技術(shù)針對利福平耐藥基因檢測的敏感度、特異度、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值最高，均在90%以上，異煙肼、鏈霉素耐藥基因檢測次之，四項指標(biāo)在75%～80%，對乙胺丁醇耐藥基因檢出敏感度和陽性預(yù)測值僅為50%左右。根據(jù)Kappa值判定可靠性標(biāo)準(zhǔn)：0.41～0.8為中高度，0.81～1.0為最強(qiáng)度。反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇耐藥基因的Kappa值依次為0.85、0.56、0.57和0.31，這說明反向點(diǎn)雜交實驗對于4種一線藥物用藥選擇的指導(dǎo)意義不盡相同，其中對利福平、異煙肼、鏈霉素耐藥評價可靠性較高，而對于乙胺丁醇耐藥評價可靠性較低，原因可能與檢測膜條僅覆蓋embB基因306位密碼子少數(shù)高頻突變位點(diǎn)有關(guān)，可結(jié)合后期細(xì)菌學(xué)實驗結(jié)果，調(diào)整治療方案。

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，聯(lián)合應(yīng)用熒光定量PCR和反向點(diǎn)雜交技術(shù)可快速、直接從痰標(biāo)本中篩選出耐藥結(jié)核分枝桿菌，在制定預(yù)防措施控制交叉感染同時，利用耐藥基因檢測結(jié)果，有助于早期制定個體化的治療方案。

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張炳昌(E-mail: zhangbingchangb@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.022

R466.5

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1002-266X(2016)31-0069-03

2016-05-12)