10% EDTA、5%硝酸用于大鼠顳骨脫鈣處理的效果對比觀察

卓洋，王巧，楊聰穎，陳昊，李愛民

(徐州醫學院附屬連云港醫院，江蘇連云港222000)

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10% EDTA、5%硝酸用于大鼠顳骨脫鈣處理的效果對比觀察

卓洋，王巧，楊聰穎，陳昊，李愛民

(徐州醫學院附屬連云港醫院，江蘇連云港222000)

目的觀察并比較10%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)和5%硝酸脫鈣處理大鼠顳骨的效果。方法 SD大鼠10只，隨機分為EDTA組和硝酸組，取出大鼠顳骨后分別置于10% EDTA、5%硝酸脫鈣液中進行脫鈣處理。觀察兩組脫鈣效果，記錄脫鈣時間，采用甲苯胺藍染色進行顳骨組織形態學觀察，采用免疫熒光雙標染色檢測α-tubulin蛋白、水通道蛋白1(AQP1)。結果 兩組取材過程中，顱骨硬度適當，顳骨可輕松切下，無砂礫感，切下的顳骨無松散及組織脫落。硝酸組脫鈣所需時間分別為(11.20±0.83)d、(26.20±2.38)min，兩組相比，P<0.05。EDTA組顳骨整體形態保持完好，蝸管、鐙骨肌、巖動脈、神經元、雪旺細胞、郎飛結、神經干可清晰辨識；硝酸組顳骨整體結構保存較理想，神經元形態保持尚可，但存在骨質染色不均、雪旺細胞崩解、軸突腫脹、郎飛結消失現象。EDTA組顳骨脫鈣后AQP1、α-tubulin蛋白定位準確，組織區分度高；硝酸組由于細胞膜中AQP1遭受破壞、位于微管內的α-tubulin蛋白漏出細胞，熒光消減明顯，組織形態保持較差。結論 10% EDTA和5%硝酸用于大鼠顳骨脫鈣處理效果均較好，兩種脫鈣液均適用于普通病理及結構觀察，若用于蛋白定量及定性方面研究，應首選10% EDTA。

骨脫鈣技術；乙二胺四乙酸二鈉；硝酸；顳骨

顳骨參與構成頭顱的側部與顱底，其中穿行面神經、腦膜中動脈及分支，顳骨同時容納聽覺器官及其附屬結構，顳骨骨折可造成上述結構損傷，引起相應并發癥[1]。既往研究主要通過打開顳骨獲取目標組織[2]，此法簡便快速，可獲取目標組織進行單獨研究，但易造成組織結構破壞(尤其是血管、神經等柔軟且難以取材的組織)。骨脫鈣技術成熟，為病理常規技術，但多用于單純的骨組織病理診斷。目前病理科常用的脫鈣液包括10%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)和5%硝酸等，但不同性質的脫鈣液對脫鈣后顳骨內部組織形態及蛋白定位、含量的影響少有報道。2015年6～10月，我們分別采用10% EDTA和5%硝酸對大鼠整個顱骨進行脫鈣處理，觀察并比較脫鈣后顳骨內結構及蛋白定位、含量變化，為后期研究提供參考。

1　材料與方法

1.1實驗動物與材料正常成年健康雄性SD大鼠10只，體質量200～250 g，隨機分為EDTA組及硝酸組各5只。4%、10%多聚甲醛，0.25%甲苯胺藍染液，0.5%冰醋酸溶液，梯度乙醇，二甲苯，兔抗大鼠水通道蛋白1(AQP1)一抗，小鼠抗大鼠α-tubulin蛋白一抗，CY3標記山羊抗兔二抗，Fitc標記山羊抗小鼠二抗，山羊血清工作液，DAPI工作液。Leica RM2235超薄切片機，奧林巴斯熒光顯微鏡。

1.2顱骨的取材及固定兩組大鼠以10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉，劍突下剪開皮膚、暴露心臟，生理鹽水于左心室內灌注至大鼠四爪及雙肺顏色變白，換用新鮮配制的4%多聚甲醛經左心室灌注、固定，灌注成功的標志為大鼠全身僵硬，所灌注的大腦色白、質硬。于頸枕交界處將大鼠斷頭，銳性清除頭顱皮膚、外耳、肌肉等附屬組織，暴露出完整顱骨；自枕骨大孔處向前去除頂骨，掀起大腦，剪斷顱神經，去除大腦；將顱骨置于10%多聚甲醛溶液內，4 ℃冰箱內固定4 h，0.9%生理鹽水沖洗后進行脫鈣處理。

1.3脫鈣液配制及顱骨脫鈣方法EDTA脫鈣液：EDTA 10 g加入100 mL的雙蒸水中，加入NaOH(1 mmol/L)將pH調至9.0。硝酸脫鈣液：將濃硝酸5 mL緩慢加入95 mL的雙蒸水中。EDTA組和硝酸組分別采用10% EDTA、5%硝酸脫鈣液進行脫鈣處理。將固定好的頭顱標本置于相當于10倍顱骨體積的脫鈣液中。加蓋放入4 ℃冰箱，定期更換脫鈣液，觀察脫鈣情況，以切片機刀片切割顱骨柔軟且無砂礫感為脫鈣終點。

1.4顳骨石蠟切片的制備取兩組脫鈣完全后的頭顱以蒸餾水沖洗10 min，去除標本中的脫鈣液，將大鼠頭顱置于頭顱模具中，分別沿頭顱正中及雙眼眶后緣連線取出顳骨。常規脫水、透明、包埋，沿矢狀位做厚度10 μm連續切片，制備好的石蠟切片置于70 ℃烤箱中烘烤4 h，常規脫蠟及梯度乙醇水化后分別進行甲苯胺藍染色及免疫熒光雙標染色。

1.5顱骨組織形態觀察采用甲苯胺藍染色法。將標本置于37 ℃的0.25%甲苯胺藍染缸內3 min，流水洗去浮色，0.5%冰醋酸溶液1 min，梯度乙醇脫水5 s，二甲苯透明30 s，封片，顯微鏡下拍照。

1.6顱骨組織中AQP1、α-tubulin蛋白檢測采用免疫熒光雙標染色。將標本以0.01 mol/L PBS浸洗5 min×3次，浸入抗原修復液中，100 ℃水浴鍋內水浴10 min；0.01 mol/L PBS浸洗5 min×3次；加入山羊血清工作液37 ℃封閉60 min，傾去，不洗；加入AQP1(1∶500)及α-tubulin(1∶1 000)一抗，濕盒，4 ℃過夜；恢復室溫，0.01 mol/L PBS浸洗5 min×5次；加入CY3(1∶1 000)及Fitc(1∶500)標記的二抗，濕盒，避光，37 ℃ 120 min；恢復室溫，0.01 mol/L PBS浸洗5 min×5次；DAPI復染，濕盒，避光，室溫5 min；0.01 mol/L PBS浸洗5 min×3次；防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。AQP1、α-tubulin蛋白分別定位于細胞膜及細胞質，鏡下選取膝狀神經節為目標結構，分別使用紅色、綠色通道觀察膝狀神經節中2種蛋白的熒光強度，將熒光信號通過攝像機轉換為數字圖像，在計算機上使用Image J軟件測算兩種熒光的平均熒光強度，代表目的蛋白相對表達量。

1.7統計學方法采用SPSS13.0統計軟件進行分析。計量資料比較采用獨立t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

兩組取材過程中，顱骨硬度適當，顳骨可輕松切下，無砂礫感，切下的顳骨無松散及組織脫落。EDTA組、硝酸組脫鈣所需時間分別為(11.20±0.83)d、(26.20±2.38)min，兩組相比，P<0.05。

EDTA組甲苯胺藍染色均一，顳骨整體形態保持完好，蝸管、鐙骨肌、巖動脈、神經元、雪旺細胞、郎飛結、神經干可清晰辨識。硝酸組顳骨整體結構保存較理想，神經元形態保持尚可，但存在骨質染色不均、雪旺細胞崩解、軸突腫脹、郎飛結消失現象。詳見圖1。

EDTA組熒光清晰明亮，背景干凈，邊緣清楚，AQP1、α-tubulin蛋白定位準確，組織區分度高，硝酸組三種熒光都存在消減，尤其是紅色熒光最為嚴重，綠色熒光暈染，邊緣模糊，組織形態保持較差。EDTA組、硝酸組綠色熒光強度分別為30.23±7.32、17.56±6.58，紅色熒光強度分別為42.84±8.24、12.85±4.11，藍色熒光強度分別為35.69±6.58、20.47±5.75，兩組相比，P均<0.05。詳見圖2。

注：A、B、C為EDTA組；D、E、F為硝酸組。

圖1兩組顳骨脫鈣后組織形態觀察

注：A、B、C、D分別為EDTA組α-tubulin、AQP1、DAPI及三種熒光Merge后圖像；a、b、c、d分別為硝酸組α-tubulin、AQP1、DAPI及三種熒光Merge后圖像。

圖2兩組脫鈣后顳骨中α-tubulin、AQP1蛋白定位及表達

3　討論

骨組織中富含鈣鹽，硬度較高，直接切片難度較大。目前通行的方法是使用脫鈣法將其中的鈣鹽去除，待骨質變軟后進行切片。脫鈣技術是目前最常用的骨組織處理方法，主要用于質硬的骨組織或含有骨組織的腫瘤的預處理[3]。脫鈣液的選擇對于后期制片及診斷具有重要意義。脫鈣試劑大致可分為酸性脫鈣液(硝酸、鹽酸、硫酸、甲酸等)及鈣絡合劑(EDTA、檸檬酸鈉)兩種[4～6]。

酸性脫鈣液能與鈣鹽迅速反應，由于所選酸性脫鈣液溶劑濃度及骨質質地不同，至脫鈣終點所需的時間也存在差異，在數分鐘至數小時不等[5，7]。酸性脫鈣液中的酸與鈣鹽反應迅速，可實現快速脫鈣，且酸性脫鈣液具有配置簡單、對反應條件要求不高等優勢，能夠滿足常規病理尤其是快速病理的需求。近年來，酸性脫鈣液出現許多改進，如將兩種或兩種以上的脫鈣液進行混合，或化學脫鈣和物理方法結合等[8,9]，但其基本化學反應本質并沒有發生改變，仍為酸性溶液與鈣鹽反應。蛋白質及核酸與酸性脫鈣液進行化學反應可出現不可逆的變性，可能對后期分子定位及定量評價造成影響；另外，酸與鈣鹽的反應為分解反應，期間產生的小氣泡及熱量易造成組織結構變形、破壞，難以做到原位觀察[10]。因此，酸性脫鈣液的適用范圍僅限于普通染色進行大體形態學觀察，若進行分子或細胞結構(細胞膜、細胞核)研究，則需要尋找一種對抗原親和力高且對組織形態影響小的脫鈣方法。絡合劑能與骨質中的鈣離子進行螯合反應，形成可溶的非離子螯合物從而實現脫鈣目的。與酸性脫鈣液最大的不同之處在于，上述螯合反應在中性條件下進行，過程溫和，不產生氣泡，對蛋白質親和性較高[11]。但螯合反應進行緩慢，其最大的缺點在于脫鈣周期較長(需兩周至一個月)，在脫鈣過程中需不斷更換脫鈣液且每天判斷脫鈣終點才能獲得良好的脫鈣效果[12]。

在涉及動物模型的研究中，常常需對蛋白進行原位標記和觀察，在處理組織過程中，保持組織形態及抗原完整顯得尤為重要。顳骨內骨質不均一，結構精細，包含神經、肌肉、血管等不同質地的組織[13]。脫鈣前對顳骨進行取材將不可避免地擠壓、震動顳骨，造成其內部結構移位、碎裂，取材也難以做到精確。因此我們在顳骨取材前對大鼠整個頭顱骨進行脫鈣處理，保證顳骨內結構完整。脫鈣前清除顱骨附著的骨膜、肌肉等附屬組織，有利于顱骨與脫鈣液接觸，加快脫鈣進程，保證脫鈣效果。另外，由于大鼠頭顱骨之間結合疏松，骨質較軟，清除顱骨附著組織時應避免牽拉和擠壓而造成顱骨結構破壞，宜使用鋒利的剪刀、刀片小心修剪，避免暴力牽拉。由于EDTA脫鈣周期較長，我們在脫鈣前使用多聚甲醛對大鼠顱骨進行固定，可進一步保護顳骨內蛋白質，最大限度保存蛋白質的抗原性[14]。我們利用顳骨解剖學特點，選擇定位于細胞膜內的AQP1[15]及定位于胞質內的α-tubulin[16]作為目標蛋白，實現對顳骨內不同組織結構蛋白表達的觀察。

我們發現，兩組取材過程中，顱骨硬度適當，顳骨可輕松切下，無砂礫感，切下的顳骨無松散及組織脫落。EDTA組脫鈣所需時間長于硝酸組。EDTA組顳骨整體形態保持完好，蝸管、鐙骨肌、巖動脈、神經元、雪旺細胞、郎飛結、神經干可清晰辨識；硝酸組顳骨整體結構保存較理想，神經元形態保持尚可，但存在骨質染色不均、雪旺細胞崩解、軸突腫脹、郎飛結消失現象。EDTA組顳骨脫鈣后AQP1、α-tubulin蛋白定位準確，組織區分度高；而硝酸組由于細胞膜中AQP1遭受破壞、位于微管內的α-tubulin蛋白漏出細胞，熒光消減明顯，組織形態保持較差。結合上述研究結果，我們認為，10% EDTA和5%硝酸脫鈣處理各有優點，對于脫鈣液的選擇應結合自身實驗條件及目的。硝酸脫鈣液適用于時間緊張的解剖學研究，對于時間寬松且對圖片質量要求較高的實驗，不論是形態學還是分子學定位及定量研究，應首選EDTA脫鈣液。

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李愛民(E-mail: liaimin6529@hotmail.com)

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R446.6

A

1002-266X(2016)31-0043-03

2016-01-30)