轉染miR-200b基因的鼻咽癌CNE2細胞增殖、侵襲能力變化及其機制

張先鋒，黃遠見，肖娟

(南華大學附屬第二醫院，湖南衡陽421000)

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轉染miR-200b基因的鼻咽癌CNE2細胞增殖、侵襲能力變化及其機制

張先鋒，黃遠見，肖娟

(南華大學附屬第二醫院，湖南衡陽421000)

目的觀察轉染miR-200b基因的鼻咽癌CNE2細胞增殖及侵襲能力變化，并探討其機制。方法 將鼻咽癌CNE2細胞分為觀察組1、對照組1、觀察組2、對照組2、觀察組3。觀察組1轉染miR-200b模擬物，對照組1轉染無關序列，觀察組2轉染BMI-1小干擾RNA(BMI-1 siRNA)，對照組2轉染RNA干擾無關序列，觀察組3轉染miR-200b抑制劑與BMI-1 siRNA。采用MTT實驗觀察細胞增殖能力，采用Transwell侵襲實驗觀察細胞侵襲能力。采用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測BMI-1結合位點熒光素酶活性，Western blotting法檢測BMI-1蛋白，qRT-PCR檢測BMI-1 mRNA。結果 觀察組1與對照組1相比，觀察組2與對照組2相比，細胞48、72、96 h增殖能力減弱，(P均<0.05)。觀察組1、對照組1、觀察組2、對照組2、觀察組3穿膜細胞數分別為(77.5±8.5)、(147.7±13.6)、(81.2±7.4)、(149.1±10.8)、(126.4±11.2)個；觀察組1與對照組1相比，觀察組2與對照組2相比，P均<0.01。miR-200b能與BMI-1非編碼區結合，抑制BMI-1蛋白、mRNA的表達。結論 轉染miR-200b基因的鼻咽癌CNE2細胞增殖與侵襲能力降低，這可能是通過下調BMI-1實現的。

鼻咽癌；微小RNA-200b；細胞增殖；細胞侵襲

微小RNA(miRNA)是非編碼小RNAs，其在轉錄后基因表達調控起重要的作用[1]。在miR-200家族中，miR-200b被認為是調控腫瘤上皮間質化(EMT)及腫瘤細胞耐藥性最重要的家族成員，在腫瘤中的作用越來越被重視[2]。研究[3]表明，miR-200b可通過靶向調控鋅指轉錄因子4(GATA4)，進而下調細胞周期蛋白D1的表達，誘導細胞分化，miR-200b表達缺失可促進乳腺癌細胞向干細胞轉化。研究[4]表明，miR-200b在鼻咽癌組織中表達下調，具有抑制鼻咽癌生長的作用，但具體作用機制尚不清楚。因此，本研究觀察了轉染miR-200b基因的鼻咽癌CNE2細胞增殖及侵襲能力變化，并探討其機制。

1　材料與方法

1.1主要材料鼻咽癌CNE2細胞株由南華大學腫瘤研究所惠贈；TRIzol和Lipofectamin2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；基質膠與Transwell小室購于康寧公司(美國)；miR-200b模擬物(miR-200b mimics)、無關序列(scramble)、miR-200b抑制劑(miR-200b inhibitors)、BMI-1小RNA干擾(BMI-1 siRNA)、RNA干擾無關序列(control siRNA序列)均由Ambion公司設計合成；BMI-1 3′UTR的各種報告基因由復能基因公司構建；RNA抽提試劑盒購于Ambion公司(美國)；BMI-1和β-actin抗體購于Santa Cruz公司(美國)。

1.2細胞分組與轉染培養鼻咽癌CNE2細胞，采用胰酶消化預先培養好的CNE2細胞并接種于6孔板中，按2 mL/孔鋪好，培養至細胞匯合度為30%～50%時用于轉染。用滅菌的無酶水稀釋上述各種轉染質粒干粉，按說明配制成20 μmol/L的溶液備用。用不含血清的Opti-MEM培養液分別稀釋100 pmol轉染質粒與5 μL的Lipofectamin2000，混勻，室溫孵育5 min。將鼻咽癌CNE2細胞分為觀察組1、對照組1、觀察組2、對照組2、觀察組3，觀察組1轉染miR-200b mimics，對照組1轉染scramble，觀察組2轉染BMI-1 siRNA，對照組2轉染control siRNA，觀察組3轉染miR-200b inhibitors與BMI-1 siRNA，培養48 h，收獲細胞。

1.3miR-200b對細胞增殖能力的影響觀察采用MTT實驗。使用胰酶消化上述5組細胞，分別取1 000個細胞接種于96孔板中，每組設5個復孔，在未接種細胞的孔中加入RPMI1640作調零孔。置于37 ℃、5% CO2培養箱中分別培養24、48、72、96 h后，每孔加20 μL MTT液，37 ℃繼續孵育4 h，每孔中加入DMSO 150 μL，低速振蕩10 min。使用多功能酶標儀，于570 nm波長處測定其OD值，同時設置490 nm波長的背景對照，實驗重復3次。OD值代表細胞增殖能力。

1.4miR-200b對細胞侵襲能力的影響觀察采用Transwell侵襲實驗。將基質膠稀釋液鋪置在transwell小室中，放置成膜。取100 μL上述5組細胞稀釋液接種至小室上腔，取500 μL含10%胎牛血清培養基添加至下腔，小室放置在37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養36 h后取出，擦棄小室上層細胞并用4%甲醛固定，0.1%結晶祡染色，PBS液洗滌，晾干。光學顯微鏡下觀察并隨機選取4個高倍視野進行細胞計數，取平均值。

1.5CNE-2細胞中miR-200b與BMI-1靶向關系驗證方法①采用雙熒光素酶報告基因檢測系統觀察miR-200b對BMI-1結合位點熒光素酶活性。根據BMI-1基因3′UTR序列與miR-200b結合位點設計合成野生型引物序列(BMI-1-wt)以及突變體引物序列(BMI-1-mut)，上下游引物分別引入限制性內切酶Spe Ⅰ和HindⅢ識別位點。當相應的正義和反義鏈擴增退火完成后，將其連接到含有熒光素酶報告基因的載體質粒上。將鼻咽癌CNE-2細胞分為實驗組1、2、3、4組，實驗組1轉染miR-200b、BMI-1-wt，實驗組2轉染scramble、BMI-1-wt，實驗組3轉染miR-200b、BMI-1-mut，實驗組4轉染scramble、BMI-1-mut，48 h后收獲細胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光素酶活性，實驗獨立重復3次。②采用Western blotting法觀察miR-200b對BMI-1蛋白的影響。將鼻咽癌CNE-2細胞接種到24孔板中，分別轉染miR-200b mimics與scramble序列，48 h后收集細胞，并提取細胞總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒測定細胞蛋白，100 ℃水浴10 min，取等量的總蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，并轉至PVDF膜上。TBST洗膜，用含有5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h后分別加入鼠抗人BMI-1單克隆一抗4 ℃封閉過夜。去除一抗，TBST洗膜3次，加入二抗，37 ℃孵育45 min，TBST洗膜3次，暗室中用蛋白熒光檢測試劑盒顯示結果于X光片。掃描圖片，以灰度值作為蛋白相對表達量。③采用qRT-PCR觀察miR-200b對BMI-1 mRNA的影響。將鼻咽癌CNE-2細胞接種到24孔板中，分別轉染miR-200b mimics與scramble序列，48 h后收集細胞，并抽提細胞中總RNA。逆轉錄合成cDNA于-80 ℃冰箱保存。PCR擴增反應體系為20 μL，其中miR-PCR primers(5 mmol/L)0.4 μL、miRNA RT product 2.0 μL、Taq DNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL、2×SYBR Mix 10 μL、滅菌蒸餾水7.4 μL。混勻，反應條件如下：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環；溶解曲線條件為95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以U6 snRNA為內參，所測定的BMI-1 mRNA的相對表達量采用2-ΔΔCt法分析。

2　結果

2.1各組鼻咽癌CNE2細胞增殖能力比較結果見表1。

表1　不同培養時間各組鼻咽癌CNE2細胞OD值比較

注：與對照組1相比，*P<0.05，**P<0.01；觀察組2與對照組2相比，#P<0.05，##P<0.01。

2.2各組CNE2細胞侵襲能力比較觀察組1、對照組1、觀察組2、對照組2、觀察組3穿膜細胞數分別為(77.5±8.5)、(147.7±13.6)、(81.2±7.4)、(149.1±10.8)、(126.4±11.2)個；觀察組1與對照組1相比，觀察組2與對照組2相比，P均<0.01；觀察組3與對照組1、對照組2相比，P均>0.05。

2.3CNE-2細胞中miR-200b與BMI-1的靶向關系實驗組1、2、3、4組CNE2細胞熒光素酶活性強度分別為0.543±0.048、0.926±0.087、0.882±0.075、0.904±0.069；實驗1組與實驗2組比較，P<0.01；實驗3組與實驗4組比較差異無統計學意義。鼻咽癌CNE2細胞轉染miR-200b mimics 48 h后BMI-1蛋白灰度值為0.458±0.044，較轉染scramble者(1.144±0.111)下調(P<0.01)。鼻咽癌CNE2細胞轉染miR-200b mimics 48 h后BMI-1 mRNA表達值為0.394±0.052，較轉染scramble者(0.925±0.086)明顯下調(P<0.01)。

3　討論

miRNA失調與多種疾病病理過程相關。Calin等[5]發現，大約19%的編碼miRNA基因區域位于鄰近脆性位點，大約50%位于腫瘤相關的基因組區域，其中43%位于雜合子缺失或基因擴增區域。位于肺癌基因組擴增區域的miR-21和miR-205具有促進肺癌發生發展的重要作用[6]，而位于肺癌基因組缺失區域的miR-126、miR-186起抑制肺癌細胞增殖的作用[7,8]。這些數據提示miRNA很可能在腫瘤發生發展過程中發揮著重要的生物學作用。細胞異常增殖和侵襲對于原發腫瘤的形成、維持和進展尤為重要。miR-21通過靶向下調PTEN基因、反轉錄富含半胱氨酸蛋白(RECK)或基質金屬蛋白酶抑制因子3(TIMP3)等腫瘤抑制蛋白的表達，促進乳腺癌、肺癌和食管癌等多種腫瘤細胞在體內外的增殖、侵襲遷移、腫瘤生長和遠處轉移[9]。Let-7則可抑制多種腫瘤的細胞增殖和侵襲遷移[10]。miR-200家族能夠靶向抑制E盒結合鋅指蛋白1(ZEB1)和E盒結合鋅指蛋白2(ZEB2)促進上皮樣腫瘤細胞間質化而獲得轉移能力，因此miR-200家族表達下調可通過誘導腫瘤細胞發生EMT進而發生遠處轉移[11]。可見，miRNA既可以發揮癌基因促進腫瘤的作用，也可具有抑癌基因的特點。建立miRNA在特定腫瘤甚至某種腫瘤特定亞型中的表達譜、臨床相關性和生物學功能，闡明miRNA參與特定腫瘤發生發展的分子機制，是當前腫瘤基礎研究中的熱點。

研究[12,13]表明，miR-200b在腫瘤細胞增殖、侵襲與轉移過程中發揮重要作用。在上皮性腫瘤中miR-200b可以調控腫瘤細胞EMT轉化、細胞增殖及細胞耐藥性產生[14]。miR-200b在前列腺癌與胃癌中參與EMT、腫瘤干細胞的形成與維持以及腫瘤的侵襲[15,16]。miR-200b能抑制鼻咽癌細胞的生長[4]，然而miR-200b在鼻咽癌發展過程中的具體調控機制目前尚未明確。本研究通過熒光素酶報告載體系統證實BMI-1是miR-200b的靶基因，miR-200b高表達能直接抑制鼻咽癌細胞中BMI-1蛋白、mRNA的表達。BMI-1調控的染色質沉默參與多種基本細胞過程，如細胞增殖、凋亡、衰老、EMT以及干細胞維持[17,18]。BMI-1在多種人類惡性腫瘤(如白血病、肺癌、腸癌、乳腺癌以及頭頸癌)中高表達，且其表達往往與腫瘤的臨床分期、病理分級、治療反應以及預后相關[19～22]。此外，BMI-1在維持正常和惡性腫瘤干細胞的自我更新能力中也擔任不可或缺的角色[17,23,24]。研究[25]表明，沉默細胞中BMI-1的表達能抑制細胞增殖、誘導凋亡，還能增強細胞對化療藥物的敏感性。這些研究都證實BMI-1在腫瘤發生過程中是重要的多向致癌調控因子，阻斷BMI-1表達/活化以及其下游信號級聯是一種很有前途的新型抗癌治療策略。本研究沉默鼻咽癌細胞中的BMI-1后，細胞的增殖與侵襲能力均明顯受到抑制，且與在鼻咽癌細胞中外源高表達miR-200b的效果相當。我們發現觀察組3與對照組1、對照組2細胞的增殖與侵襲能力差異無統計學意義，提示miR-200b可能通過下調BMI-1抑制鼻咽癌細胞增殖與侵襲。

綜上可見，轉染miR-200b基因的鼻咽癌CNE2細胞增殖與侵襲能力降低，這可能是通過下調BMI-1表達實現的。

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A

1002-266X(2016)31-0034-04

2016-01-09)