可溶性CD40配體對人B細胞淋巴瘤細胞系BJAB增殖、凋亡的影響及其機制

任明強，陳琦，毛星星

(遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563003)

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可溶性CD40配體對人B細胞淋巴瘤細胞系BJAB增殖、凋亡的影響及其機制

任明強，陳琦，毛星星

(遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563003)

目的觀察可溶性CD40配體(sCD40L)對人B細胞淋巴瘤細胞系BJAB增殖、凋亡的影響，并探討其機制。方法 培養BJAB細胞并將其分為實驗組、陽性對照組、空白對照組。實驗組分別加入0、1、2、3、4、5、6、7 g/mL的sCD40L，空白對照組加入同量生理鹽水，陽性對照組加入10 mol/L的地塞米松。用不同濃度為的sCD40L作用于BJAB細胞，在24、48、72 h用MTT 法測算細胞增殖抑制率；應用流式細胞術觀察凋亡細胞及不同周期細胞；采用Western blotting法檢測細胞中的Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白。結果 陽性對照組及實驗組不同濃度sCD40L處理的細胞培養48、72 h后增殖抑制率高于培養24 h時(P均<0.05)。隨著sCD40L作用濃度升高，實驗組BJAB細胞增殖抑制率升高。實驗組、陽性對照組G1期細胞百分比增高，S期細胞百分比下降；實驗組中，6 g/mL亞組G1期細胞百分比高于2、4 g/mL亞組，S期細胞百分比低于2、4 g/mL亞組(P均<0.05)。實驗組、陽性對照組細胞凋亡率高于空白對照組(P均<0.05)；實驗組中6 g/mL亞組細胞凋亡率低于陽性對照組(P<0.05)。實驗組及陽性對照組細胞中Bax、Caspase-3蛋白相對表達量高于空白對照組，Bcl-2蛋白相對表達量低于空白對照組(P均<0.05)。結論 sCD40L可抑制BJAB細胞增殖、誘導其凋亡，機制可能與上調Bax、Caspase-3蛋白表達及下調Bcl-2蛋白表達和干擾細胞周期有關。

可溶性CD40配體；淋巴瘤;B細胞淋巴瘤；細胞增殖；細胞周期；細胞凋亡

B細胞淋巴瘤是一種在病理形態、臨床表現、治療及預后等方面都有較大異質性的惡性腫瘤[1]。在亞洲國家，B細胞淋巴瘤約占淋巴瘤的60%，以40～50歲者多見。部分B細胞淋巴瘤患者在標準R-CHOP方案化療、自體造血干細胞移植治療后，仍容易復發，長期生存率低，故探索新的治療藥物與治療策略尤為必要。CD40配體(CD40L)主要表達于T淋巴細胞和活化的血小板，在肥大細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞中也有表達。CD40L在血漿中以可溶性蛋白形式(sCD40L)存在，sCD40L可參與抗腫瘤免疫反應，可通過抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞從G0期進入G1期，從而誘導細胞凋亡[2]。目前，關于sCD40L對人B細胞淋巴瘤細胞的作用所知甚少。我們前期研究顯示，sCD40L在惡性淋巴瘤患者血清中呈顯著低表達，可作為彌漫大B細胞淋巴瘤患者有價值的預后指標。研究[3,4]也顯示sCD40L在彌漫大B細胞淋巴瘤中呈低表達。然而關于sCD40L在B細胞淋巴瘤中的具體作用機制還不明確。因此，本研究采用不同濃度的sCD40L處理BJAB細胞，觀察其增殖、凋亡和細胞周期分布情況，并檢測相關凋亡蛋白，探討sCD40L對BJAB細胞的作用及可能機制。

1　材料與方法

1.1細胞、試劑與儀器人B細胞淋巴瘤細胞系BJAB購自中國科學院上海細胞生物研究所。sCD40L，鏈霉素，青霉素，Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡試劑盒，化學發光試劑盒，MTT試劑盒、DMSO、蛋白提取試劑盒，BCA蛋白質定量試劑盒，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，PVDF膜，Bcl-2/Bax/Caspase-3一抗及二抗。CO2培養箱，倒置相差顯微鏡，超凈工作臺，酶標測定儀，恒溫烤箱，分析天平，臺式低速離心機，低溫高速離心機，低溫冰箱，24孔及96孔培養板，流式細胞儀，細胞培養瓶，Image Lab凝膠成像儀。

1.2細胞分組與sCD40L用法復蘇后的BJAB細胞用含10%滅活胎牛血清的1640培養基置入37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養，每2～3 d用0.25%胰酶消化并1∶2傳代，定期觀察細胞形態學變化。取對數生長期的BJAB細胞接種到96孔板中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養24 h后吸出原培養液。將BJAB細胞分為實驗組、空白對照組和陽性對照組。實驗組分別加入1、2、3、4、5、6、7 g/mL的sCD40L，空白對照組加入同量生理鹽水，陽性對照組加入10 mol/L的地塞米松。每組5個復孔。

1.3BJAB細胞增殖抑制率測算采用MTT法。各組繼續培養24、48、72 h后加入MTT 20 μL，繼續培養4 h后終止培養，棄上清，每孔加入 DMSO 100 μL震蕩10 min以溶解結晶。在570 nm波長下用酶聯免疫監測儀測量吸光度(OD)值，細胞增殖抑制率=(1-實驗組成陽性對照組OD值)/對照組OD值×100%。

1.4BJAB細胞周期檢測及凋亡情況觀察培養48 h后收集空白對照組、陽性對照組細胞，收集實驗組經2、4、6 g/mL的sCD40L處理的細胞，PBS洗滌細胞2次，加70%乙醇1 mL固定，4 ℃冰箱過夜，離心后再用PBS洗3次，加入牛胰核糖核酸酶，37 ℃孵育30 min，碘化丙啶(PI)4 ℃避光染色，流式細胞儀檢測，以ModFit LT軟件分析并計算各時相細胞百分比。用500 μL的PBS重懸細胞，加入的Annexin V-FITC避光孵育15 min，再加入PI避光孵育5 min，流式細胞儀分析并計算細胞凋亡率。

1.5BJAB細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白檢測培養48 h后收集空白對照組、陽性對照組細胞及實驗組經2、4、6 g/mL的sCD40L處理的細胞，PBS洗2次，裂解，離心，收集上清，按蛋白提取試劑盒操作步驟提取細胞總蛋白；在上樣緩沖液加入等量蛋白，煮沸，在SDS聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，電轉至PVDF膜，封閉液室溫封閉75 min；分別加入Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAPDH一抗4 ℃過夜，加入HRP標記二抗，搖床上室溫孵育1 h，滴加發光試劑；圖片經圖像掃描儀掃描，采用AlphaEase FC軟件對圖片進行灰度值分析。以GAPDH作內參，以相對于對照組灰度值的倍數表示目的蛋白相對表達量。

1.6統計學方法采用SPSS18.0軟件進行統計分析。計量資料多樣本均數比較采用單因素方差分析；分類變量比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組BJAB細胞增殖抑制率比較陽性對照組及實驗組不同濃度sCD40L處理的細胞培養48、72 h后增殖抑制率高于培養24 h時(P均<0.05)。隨著sCD40L作用濃度升高，實驗組BJAB細胞增殖抑制率升高。詳見表1。

表1　各組BJAB細胞增殖抑制率比較

注：與同組培養24 h時相比，*P<0.05。

2.2各組不同周期細胞分布及細胞凋亡率比較實驗組、陽性對照組G1期細胞百分比增高，S期細胞百分比下降；實驗組中，6 g/mL亞組G1期細胞百分比高于2、4 g/mL亞組，S期細胞百分比低于2、4 g/mL亞組(P均<0.05)。實驗組、陽性對照組細胞凋亡率均高于空白對照組(P均<0.05)；實驗組中6 g/mL亞組細胞凋亡率與陽性對照組無統計學差異。詳見表2。

表2　各組細胞周期細胞分布、細胞凋亡率比較±s)

注：與空白對照組相比，*P<0.05；與實驗組6 g/mL亞組相比，#P<0.05。

2.3各組細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達比較實驗組及陽性對照組細胞中Bax、Caspase-3蛋白相對表達量高于空白對照組，Bcl-2蛋白相對表達量低于空白對照組(P均<0.05)。見表3。

3　討論

B細胞淋巴瘤作為一種常見的淋巴瘤類型，目前主要采用利妥昔單抗聯合CHOP方案(環磷酰胺、阿霉素、長春新堿和強的松)進行標準一線治療，治療效果總體較好，但由于該腫瘤有高度異質性，治療中易出現耐藥、復發，影響患者預后與長期生存[5]，進一步尋找新的治療藥物與策略尤為必要。CD40L屬于腫瘤壞死因子超家族一員，sCD40L具有與膜性CD40L相同的生物學作用，在腫瘤細胞增殖調控、免疫應答及抗原遞呈方面發揮重要作用[6]。近年來，sCD40L體外對腫瘤細胞生物活性的影響成為研究熱點。sCD40L是一種跨膜糖蛋白，是CD40L在血漿中存在的形式，具有細胞因子樣活性[7]。大量研究表明，sCD40L在胃癌、肺癌和肝癌等多種腫瘤中有免疫正向調節和抗腫瘤作用，可誘導腫瘤細胞凋亡[8,9]。我們前期研究發現，sCD40L在淋巴瘤、白血病患者外周血中低表達，sCD40L缺乏與淋巴瘤、白血病的發病有關[10,11]。

表3　各組細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對表達量比較

注：與空白對照組相比，*P<0.05。

地塞米松是淋巴系統血液腫瘤化療常用的藥物之一，對淋巴瘤細胞有抑制、殺滅作用，故本研究將地塞米松作為陽性對照組，目的是為觀察sCD40L對淋巴瘤的作用提供參照。本研究采用不同濃度的SCD40L分別處理BJAB細胞24、48、72 h后，發現sCD40L可明顯抑制細胞增殖，并呈一定的時間和劑量效應關系，這可能與sCD40L抑制DNA復制過程中關鍵酶活性、影響生長調節因子分泌、抑制腫瘤細胞自分泌活性氧有關。腫瘤細胞的增殖速度主要取決于細胞周期的長短，其中G1期停滯會使細胞周期增長而導致細胞出現凋亡。我們通過流式細胞術檢測發現，隨sCD40L作用濃度增加，BJAB細胞凋亡率增加，S期細胞百分比減少，G1期細胞百分比增加，提示sCD40L可使BJAB細胞的細胞周期阻滯在G1期，可能是sCD40L誘導BJAB細胞凋亡的機制之一。一些關于sCD40L與其他腫瘤細胞的研究也支持上述觀點[12～14]。

Caspase-3是Caspase家族成員中執行細胞凋亡的關鍵酶之一，多種刺激因素都能激活Caspase-3，然后裂解多種蛋白，阻止DNA復制和細胞修復，最終引起細胞凋亡。Caspase-3活化程度也是判斷細胞凋亡程度的相關指標之一[15,16]。Bax基因位于染色體19q13,該基因具有保守性，含6個外顯子，廣泛分布于人體多種組織，Bax與Bcl-2部分氨基酸同源。Bcl-2基因位于18q21.3染色體片段，有3個外顯子，Bcl-2蛋白是Bcl-2基因表達的蛋白產物，分子量為26 kD，主要位于內質網、核膜和線粒體膜。Bcl-2可通過改變線粒體巰基的氧化還原狀態、調節線粒體膜對一些凋亡蛋白前體的通透性等機制抑制細胞凋亡[17,18]。Bcl-2與Bax、Caspase-3蛋白參與構成線粒體通路，分別具有抑制和促進細胞凋亡的作用[19，20]。本研究發現sCD40L可誘導BJAB細胞發生凋亡，同時影響細胞中凋亡相關蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達。隨著sCD40L作用濃度增高，促凋亡因子Caspase-3、Bax的相對表達量逐漸升高，抗凋亡因子Bcl-2的表達量逐漸降低，這提示sCD40L能使BJAB細胞線粒體中的Bcl-2/Bax/Caspase-3信號通路激活，作用機制可能為sCD40L引起Bcl-2表達減少，線粒體膜電位降低、膜通透性增高，使細胞色素C、Ca2+凋亡蛋白釋放至細胞質中，激活Caspase-3、Bax，導致蛋白質水解，破壞細胞核內染色質，促使細胞結構破壞，最終誘發細胞凋亡。

結合上述研究結果，我們認為，sCD40L在體外可抑制B淋巴瘤細胞增殖、促進其凋亡，機制可能與調控Bcl-2/Bax/Caspase-3信號通路及影響細胞周期有關。這為sCD40L用于B細胞淋巴瘤治療的相關研究提供了實驗基礎。

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Effects of soluble CD40 ligand on proliferation and apoptosis of Human B cell lymphoma cell line BJAB and its mechanism

RENMingqiang,CHENQi,MAOXingxing

(AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,China)

ObjectiveTo observe the effects of soluble CD40 ligand (sCD40L) on cell proliferation and apoptosis of human lymphoma BJAB cell line and to investigate its mechanism. MethodsBJAB cells were cultured and then were divided into the experimental group, positive control group and blank control group. The 1, 2, 3, 4, 5, 6 and 7 g/mL sCD40L were separately added to the experimental group, the same amount of normal saline was added to the blank control group, and 10 mol/L dexamethasone was added to the positive control group. Different concentrations of sCD40L were applied to BJAB cells at 24, 48 and 72 h. MTT assay and flow cytometry (FCM) were used to detect the inhibition rate, apoptosis and cell cycle distribution, respectively. Western blotting was used to detect the expression of Bax, Bcl-2 and Caspase-3. Results The proliferation inhibition rates of the positive control group and experimental group treated with different concentrations of sCD40L after 48 and 72 h was higher than that after 24 h (P<0.05). With the increase of sCD40L concentration, the proliferation inhibition rate of BJAB cells was increased in the experimental group. The cell percentage of G1phase increased both of the experimental group and positive control group, and the cell percentage of S phase decreased. In the experimental group, the cell percentage of G1phase in 6 g/mL subgroup was higher than that of 2, 4 g/mL subgroups, and the cell percentage of S phase was lower than that of 2, 4 g/mL subgroups (allP<0.05). The apoptosis rates of the experimental group and positive control group were higher than that of the control group (allP<0.05). In the experimental group, the apoptosis rate of 6 g/mL subgroup was lower than that of the positive control group (P<0.05). The relative expression of Caspase-3 and Bax protein in the experimental group and positive control group was higher than that in the blank control group, and the relative expression of Bcl-2 protein was lower than that of the control group (allP<0.05). ConclusionssCD40L can inhibit cell proliferation and induce apoptosis in BJAB cells, and the mechanism may be related to up-regulation of Bax, Caspase-3 protein expression, down-regulation of Bcl-2 protein expression and interfering with the cell cycle.

soluble CD40 ligand; B cells lymphoma; cell proliferation; cell cycle; apoptosis

貴州省科技合作計劃項目(LH20157468)。

任明強(1977-)，男，副教授，碩士，主要研究方向為CD40L分子與血液病的關系。E-mail:844198637@qq.com

任明強

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.005

R733.4

A

1002-266X(2016)31-0016-04

2016-05-04)