穩定表達Caveolin-3基因突變型P104L和P47L的C2C12骨骼肌細胞株的構建

鄧玉風，黃億元，尚麗娜，楊立會，黃勤

(1右江民族醫學院，廣西百色533000；2廣西醫科大學)

?

穩定表達Caveolin-3基因突變型P104L和P47L的C2C12骨骼肌細胞株的構建

鄧玉風1，黃億元1，尚麗娜2，楊立會2，黃勤2

(1右江民族醫學院，廣西百色533000；2廣西醫科大學)

目的構建穩定表達Caveolin-3(CAV3)基因突變型P104L和P47L的C2C12骨骼肌細胞株。方法 將野生型CAV3(CAV3-WT)、CAV3-P104L、CAV3-P47L裝在帶有GFP標簽的質粒中，構建目的基因與GFP基因融合的表達質粒，以只含GFP的載體為對照。將C2C12細胞隨機分為A、B、C、D組，分別轉染對照空載體(NC)、CAV3-WT、CAV3-P47L及CAV3-P104L。以遺傳霉素(G418)進行陽性克隆篩選，熒光顯微鏡下挑選穩定轉染的細胞系，Western blotting法檢測各組細胞中的CAV3-GFP融合蛋白，免疫熒光法檢測各組細胞中的CAV3蛋白，以熒光強度代表目的蛋白相對表達量。結果 經酶切和測序驗證，證實4種表達質粒構建成功。B、C、D組細胞中測得CAV3-GFP融合蛋白，A組未測得融合蛋白。A、B、C、D組CAV3蛋白相對表達量分別為23.0±2.25、32.3±0.35、25.6±0.92、24.3±1.42，B組CAV3蛋白表達增強，與A組相比，P<0.01；A、C、D組CAV3蛋白表達下調，與B組相比，P均<0.01。結論 成功構建了穩定表達CAV3-P47L和CAV3-P104L的C2C12細胞，兩種細胞中CAV3蛋白表達下調。

Caveolin-3；基因突變； 2型糖尿病；肢帶型肌營養不良

CAV3蛋白在1996年首次得到克隆和鑒定，它由151個氨基酸組成，是肌肉特有的微囊蛋白，僅在骨骼肌和心肌中大量表達，參與許多細胞生理過程，包括鈣離子、鈉離子和鉀離子通道調節，囊泡轉運，膽固醇水平調節及信號轉導的調控。CAV3蛋白還可維持體內葡萄糖和脂質平衡，并被認為與胰島素抵抗有關[1,2]，可能在2型糖尿病(T2DM)的發病中發揮一定作用。我們課題組前期從T2DM患者血樣中提取DNA，PCR后測序發現有較多CAV3基因突變位點[3]，如第47個氨基酸位置由脯氨酸(Pro)突變為亮氨酸(Leu)，即P47L。此突變點是否參與T2DM的發病有待研究。CAV3基因突變還與多種肌組織病變有關，其中一種人類常染色體顯性遺傳的肢帶型肌營養不良(LGMD-1C)是由于CAV3基因編碼區P104L突變導致[4～8]。目前我國人群LGMD-1C與CAV3基因P104L突變的相關性尚未見報道，其具體機制也無深入研究。為此，我們構建了穩定轉染CAV3基因突變型P104L和P47L的C2C12骨骼肌細胞株，為進一步研究打下實驗基礎。

1　材料與方法

1.1材料C2C12細胞株從中國科學院上海細胞庫引進。E.coli DH5α感受態細胞購于TIANGEN公司，表達載體購自美國Gene Copoeia公司，細胞培養試劑購于美國Gibco公司，去內毒素質粒提取試劑盒購于Omega公司，脂質體轉染試劑盒LipofectamineTM3000、G418和Alexa Fluor 647熒光二抗購自Invitrogen公司，CAV3抗體購于Santa Cruz公司，GAPDH購于Immunoway公司，遠紅外IRDye 800二抗購自Li-Cor公司。

1.2CAV3-P104L、CAV3-P47L表達質粒的構建表達質粒由Gene Copoeia公司構建并驗證，將目的基因野生型CAV3(CAV3-WT)、CAV3-P104L、CAV3-P47L裝在帶有GFP標簽的表達質粒中，CAV3-WT堿基序列是從NCBI數據庫獲取的CAV3的CDS序列，兩個突變型是在野生型的基礎上定點誘變而成。我們把CDS序列的最后3個堿基TAA(終止密碼子)去掉，則可構建CAV3與GFP的融合表達載體，以只含GFP的載體為對照。將4種載體轉化至E.coli DH5α感受態細胞中，用氨芐青霉素抗性的LB平板培養基篩選陽性克隆，在超凈臺里用10 μL槍頭挑取白色單菌落放至裝有LB/Amp(5 mL)培養基的離心管中，混勻后置于280 r/min、37 ℃搖床孵育8 h，取菌液50 μL加入LB/Amp培養基(50 mL)中繼續培養12～16 h，用去內毒素質粒提取試劑盒中量提取質粒，送上海生工測序。上游引物序列為5′-GCGGTAGGCGTGTACGGT-3′，下游引物序列為5′-CCGGACACGCTGAACTTGT-3′。

1.3CAV3-P104L、CAV3-P47L轉染C2C12細胞取對數生長期的C2C12細胞接種于6孔板，加入含10% FBS無抗生素的DMEM培養基，當細胞達到70%融合時，分為A、B、C、D組，分別轉染空載體、CAV3-WT、CAV3-P47L和CAV3-P104L。轉染24 h后按1∶10比例傳代細胞，加入含G418(400 μg/mL)的培養液進行篩選，設置未轉染的細胞作為對照。熒光顯微鏡下觀察，篩選出含綠色熒光的單克隆細胞后行擴大培養。取部分細胞待檢。

1.4轉染突變型CAV3基因C2C12細胞中CAV3蛋白檢測①Western blotting法：取各組細胞用RIPA裂解液裂解，提取細胞總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒定量蛋白濃度后，加入10% SDS-PAGE分離膠分離，用含20%甲醇的轉膜液將蛋白轉移到PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵育抗CAV3(1∶100)和抗GAPDH(1∶1 000)過夜；TBST洗3次后，用遠紅外IRDye 800(1∶10 000)二抗室溫孵育2 h；TBST洗3次，以Odyssey雙色紅外熒光掃描成像系統鑒定反應條帶。②免疫熒光法：取四組細胞接種于細胞爬片專用的蓋玻片上，每組細胞做3張爬片，待細胞長至60%～70%融合時用4%多聚甲醛固定，5% BSA封閉1 h后滴加抗CAV3抗體4 ℃孵育過夜，避光孵育Alexa Fluor 647(1∶1 000)熒光二抗1 h，用激光掃描共聚焦顯微鏡拍攝并分析，用Image Pro Plus6.0軟件測定熒光強度，作為目的蛋白相對表達量。

2　結果

從擴增的菌液提取質粒并根據載體設計引物測序驗證，測序結果與設計序列一致，與CAV3-WT序列比較，P47L、P104L突變都是由C堿基變成T堿基，導致氨基酸由脯氨酸突變為亮氨酸。

CAV3蛋白的分子量為25 kD，GFP分子量為27 kD，所以融合蛋白分子量約為52 kD。A組轉染空載體，用抗CAV3抗體未檢測到CAV3-GFP融合蛋白表達(52 kD左右無條帶)，B、C、D組在52 kD左右可檢測到條帶，說明融合蛋白表達，4組細胞篩選成功(見圖1)。共聚焦顯微鏡拍攝結果顯示，轉染CAV3-WT、CAV3-P104L、CAV3-P47L的細胞均能表達GFP，且主要定位在胞質和胞膜上，與CAV3蛋白表達情況基本一致(見圖2)。A、B、C、D組CAV3蛋白相對表達量分別為23.0±2.25、32.3±0.35、25.6±0.92、24.3±1.42，B組CAV3蛋白表達增強，與A組相比，P<0.01；A、C、D組CAV3蛋白表達下調，與B組相比，P均<0.01。

圖1　四組CAV3-GFP融合蛋白Western blotting

圖2　四組CAV3蛋白免疫熒光法檢測結果

3　討論

微囊是細胞囊膜上直徑在50～100 nm的特異性囊狀小凹結構，主要由膽固醇、鞘磷脂、糖基鞘磷脂及CAV組成。CAV是相對分子質量為21～24 kD的膜蛋白，高度富集于微囊膜，是體內細胞膜微囊的主要和特征性蛋白，在維持微囊的形態、結構和功能中起重要作用。在哺乳動物細胞中，CAV基因家族有三種亞型：CAV1、CAV2和CAV3。CAV1和CAV2共同表達于許多類型細胞中并形成異源寡聚體復合物發揮作用，特別是在脂肪細胞中有高度表達[9]。CAV3僅在骨骼肌和心肌的微囊及肌膜內陷形成的T管中高表達，因其具有肌肉特異性，推測CAV3可能對肌細胞有特殊作用[10,11]。CAV3蛋白在維持微囊正常結構及調節細胞囊泡轉運、離子通道開放、細胞內外信號轉導功能等方面起著關鍵作用。CAV3基因位于3p25區，CAV3突變蛋白通過多種可能機制引起骨骼肌、心肌等不同程度的病變，統稱微囊蛋白病[12]。目前已發現CAV3基因突變與8種典型的骨骼肌和心肌疾病有關，包括LGMD-1C、波紋肌肉病(RMD)、遠端型肌病(DM)、高CK血癥(H-CK)、肥厚型心肌病(HCM)、擴張型心肌病(DCM)、長QT綜合征(LQTS)、嬰兒猝死綜合征(SIDS)[12～17]。

在上述疾病中，LGMD-1C是研究熱點之一，該病主要特點是局限于肢體肌肉組織的無力和廢用，臨床表現為輕到中度近端肌無力，Gowers征陽性，小腿肥大，肌痛，血清CK水平是正常值的4～25倍[18]。LGMD-1C患者中最常見的CAV3突變是P104L。文獻[19～21]報道P104L突變可引起細胞膜上CAV3含量減少，導致LGMD-1C。P104L轉基因小鼠可導致LGMD-1C，伴隨著eNOS和肌生成抑制蛋白1型受體活性增加[7]。成熟的CAV3主要定位于肌膜的微囊區。P104L突變使CAV3滯留在高爾基復合體中形成不穩定的高分子聚集團，微囊蛋白生成減少、不能移位到細胞膜[20]，嚴重改變微囊蛋白的功能，導致膜修復缺陷，而膜修復缺陷將加劇病情進展[22]。我們在實驗中也發現，穩定轉染CAV3-P104L的細胞中CAV3表達量低于穩定轉染CAV3-WT的細胞，推測CAV3蛋白表達減少可能通過某些機制影響肌肉功能。

研究[23]認為，T2DM是由多種因素聯合作用引起，并不是由單一的病理生理機制導致，胰島素抵抗是T2DM的病理基礎之一。CAV3蛋白是肌肉特有的微囊蛋白，在維持體內葡萄糖和脂質平衡中發揮重要作用，與胰島素抵抗的發生也有關。有研究[24]表明，CAV3與糖尿病有密切聯系，糖尿病大鼠CAV3表達水平減少，而CAV3轉基因可恢復骨骼肌的胰島素通路[25]。CAV3可調節GLUT4易位到細胞膜表面的過程[26]，胰島素通過其受體發揮作用使胞內GLUT4轉移到細胞膜，并引導GLUT4到達特定的微囊區域，從而提高肌肉等組織對葡萄糖的攝取能力[27]。在本實驗中，我們發現轉染CAV3-P47L的細胞中CAV3蛋白表達量低于轉染CAV3-WT的細胞，提示P47L突變可能會下調CAV3的表達水平而參與T2DM的發病。

總之，CAV3基因與骨骼肌疾病、心肌疾病及T2DM的發病均有關，但CAV3在這些疾病中的發病機制尚未明確。通過CAV3敲除動物模型或體外細胞轉染實驗可進一步研究CAV3在骨骼肌和心肌中的作用，探究CAV3基因突變所致相關疾病的發病機制。我們通過穩定轉染技術，將CAV3-P104L、CAV3-P47L轉入C2C12細胞并穩定表達。在轉染的過程中，我們除了使用較好的轉染試劑，還對轉染使用的質粒進行了去內毒素處理，防止內毒素對細胞的傷害。另外，我們對細胞狀態和密度也作了調整，提高了轉染效率，有利于更準確地獲取穩定轉染細胞株。在研究中我們發現，穩定轉染CAV3-P47L和CAV3-P104L的C2C12細胞株CAV3蛋白表達量低于轉染CAV3-WT的細胞，這為進一步研究CAV3基因突變在T2DM和LGMD-1C發病中的作用機制奠定了實驗基礎。

[1] Marx J. Caveolin-3 helps build muscles[J].Science, 2001,294(5548):1864.

[2] Murfitt L, Whiteley G, Iqbal MM, et al. Targeting caveolin-3 for the treatment of diabetic cardiomyopathy[J]. Pharmacol Ther, 2015,151:50-71.

[3] 黃勤,黃億元,鄧玉風,等.Caveolin-3基因多態性的篩查及其在中國漢族糖尿病患者中的特點[J].實用醫學雜志,2014,30(11):1757-1759.

[4] Sotgia F, Woodman SE, Bonuccelli G, et al. Phenotypic behavior of caveolin-3 R26Q, a mutant associated with hyperCKemia, distal myopathy, and rippling muscle disease[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2003,285(5):C1150-1160.

[5] Weiss N, Couchoux H, Legrand C, et al. Expression of the muscular dystrophy-associated caveolin-3(P104L) mutant in adult mouse skeletal muscle specifically alters the Ca(2+) channel function of the dihydropyridine receptor[J]. Pflugers Arch, 2008,457(2):361-375.

[6] Couchoux H, Allard B, Legrand C, et al. Loss of caveolin-3 induced by the dystrophy-associated P104L mutation impairs L-type calcium channel function in mouse skeletal muscle cells[J]. J Physiol, 2007,580(Pt.3):745-754.

[7] Ohsawa Y, Hagiwara H, Nakatani M, et al. Muscular atrophy of caveolin-3-deficient mice is rescued by myostatin inhibition[J]. J Clin Invest, 2006,116(11):2924-2934.

[8] Ohsawa Y, Toko H, Katsura M, et al. Overexpression of P104L mutant caveolin-3 in mice develops hypertrophic cardiomyopathy with enhanced contractility in association with increased endothelial nitric oxide synthase activity[J]. Hum Mol Genet, 2004,13(2):151-157.

[9] Scherer PE, Lewis RY, Volonte D, et al. Cell-type and tissue-specific expression of caveolin-2. Caveolins 1 and 2 co-localize and form a stable hetero-oligomeric complex in vivo[J]. J Biol Chem, 1997,272(46):29337-29346.

[10] Parton RG, Way M, Zorzi N, et al. Caveolin-3 associates with developing T-tubules during muscle differentiation[J]. J Cell Biol, 1997,136(1):137-154.

[11] Minetti C, Bado M, Broda P, et al. Impairment of caveolae formation and T-system disorganization in human muscular dystrophy with caveolin-3 deficiency[J]. Am J Pathol, 2002,160(1):265-270.

[12] Gazzerro E, Sotgia F, Bruno C, et al. Caveolinopathies: from the biology of caveolin-3 to human diseases[J]. Eur J Hum Genet, 2010,18(2):137-145.

[13] Woodman SE, Sotgia F, Galbiati F, et al. Caveolinopathies: mutations in caveolin-3 cause four distinct autosomal dominant muscle diseases[J]. Neurology, 2004,62(4):538-543.

[14] Hayashi T, Arimura T, Ueda K, et al. Identification and functional analysis of a caveolin-3 mutation associated with familial hypertrophic cardiomyopathy[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004,313(1):178-184.

[15] Cronk LB, Ye B, Kaku T, et al. Novel mechanism for sudden infant death syndrome: persistent late sodium current secondary to mutations in caveolin-3[J].Heart Rhythm, 2007,4(2):161-166.

[16] Catteruccia M, Sanna T, Santorelli FM, et al. Rippling muscle disease and cardiomyopathy associated with a mutation in the CAV3 gene[J]. Neuromuscular disorders: NMD, 2009,19(11):779-783.

[17] Traverso M, Gazzerro E, Assereto S, et al. Caveolin-3 T78M and T78K missense mutations lead to different phenotypes in vivo and in vitro[J]. Lab Invest, 2008,88(3):275-283.

[18] Gazzerro E, Bonetto A, Minetti C. Caveolinopathies: translational implications of caveolin-3 in skeletal and cardiac muscle disorders[J]. Handbook Clin Neur, 2011,101:135-142.

[19] Couchoux H, Bichraoui H, Chouabe C, et al. Caveolin-3 is a direct molecular partner of the Cav1.1 subunit of the skeletal muscle L-type calcium channel[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2011,43(5):713-720.

[20] Galbiati F, Volonte D, Minetti C, et al. Limb-girdle muscular dystrophy (LGMD-1C) mutants of caveolin-3 undergo ubiquitination and proteasomal degradation. Treatment with proteasomal inhibitors blocks the dominant negative effect of LGMD-1C mutanta and rescues wild-type caveolin-3[J]. J Biol Chem, 2000,275(48):37702-37711.

[21] Galbiati F, Razani B, Lisanti MP. Caveolae and caveolin-3 in muscular dystrophy[J]. Trends Mol Med, 2001,7(10):435-441.

[22] Cai C, Weisleder N, Ko JK, et al. Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin[J]. J Biol Chem, 2009,284(23):15894-15902.

[23] 潘長玉,尹士男.第一講:胰島素抵抗——2型糖尿病發病機制的重要因素[J].中華內分泌代謝雜志,2000,16(1):59-60.

[24] Lei S, Li H, Xu J, et al. Hyperglycemia-induced protein kinase C beta2 activation induces diastolic cardiac dysfunction in diabetic rats by impairing caveolin-3 expression and Akt/eNOS signaling[J]. Diabetes, 2013,62(7):2318-2328.

[25] Liewluck T, Goodman BP, Milone M. Electrically active immune-mediated rippling muscle disease preceding breast cancer[J]. Neurologist, 2012,18(3):155-158.

[26] Tan Z, Zhou LJ, Mu PW, et al. Caveolin-3 is involved in the protection of resveratrol against high-fat-diet-induced insulin resistance by promoting GLUT4 translocation to the plasma membrane in skeletal muscle of ovariectomized rats[J]. J Nutr Biochem, 2012,23(12):1716-1724.

[27] Gustavsson J, Parpal S, Stralfors P. Insulin-stimulated glucose uptake involves the transition of glucose transporters to a caveolae-rich fraction within the plasma membrane: implications for type Ⅱ diabetes[J]. Mol Med, 1996,2(3):367-372.

Establishment of C2C12 skeletal muscle cell lines stably overexpressing Caveolin-3 gene P104L and P47L mutations

DENGYufeng1,HUANGYiyuan,SHANGLina,YANGLihui,HUANGQin

(1YoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,China)

ObjectiveTo construct C2C12 skeletal muscle cell lines stably expressing Caveolin-3 (CAV3) gene P104L and P47L mutations. MethodsThe wild type CAV3 (CAV3-WT), CAV3-P104L, CAV3-P47L were installed in the plasmid with GFP tag, and then we constructed the target gene and GFP gene fusion expression plasmid, with only GFP carrier as the control. C2C12 cells were randomly divided into four groups: groups A, B, C and D which were transfected with empty vector (NC), CAV3-WT, CAV3-P47L and CAV3-P104L. After treated with geneticin (G418), we selected the stable transfected cell lines under the fluorescence microscope. The expression of CAV3 and GFP fusion protein was detected by Western blotting, and the expression of CAV3 protein was detected by immunofluorescence. The relative expression of the target protein was expressed by the fluorescence intensity. Results After enzyme digestion and sequencing, the four expression vectors proved to be successfully constructed. Cell lines of groups B, C and D contained the fusion protein expression of CAV3 and GFP, but fusion protein was not detected in group A. The relative expression of CAV3 in groups A, B, C and D was 23.0±2.25, 32.3±0.35, 25.6±0.92 and 24.3±1.42. The expression of CAV3 in group B was increased compared with that of group A,P<0.01, and the expression of CAV3 in groups A, C and D was significantly decreased compared with that of B group, allP<0.01. ConclusionWe successfully constructed the C2C12 cells stably expressing CAV3-P104L and CAV3-P47L, and the expression of CAV3 protein was down-regulated in these two cells.

Caveolin-3; gene mutation; type 2 diabetes mellitus; limb girdle muscular dystrophy

鄧玉風(1989-)，女，助教，主要研究方向為2型糖尿病和肌病。E-mail： dyfgxmu@163.com

簡介：黃勤(1969-)，女，副教授，主要研究方向為2型糖尿病和肌病。E-mail： hqgxmu@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.004

R34

A

1002-266X(2016)31-0012-04

2016-02-26)