唑來膦酸對結腸癌細胞株CT26增殖、凋亡的影響及其機制探討

朱勁華，張威，劉美輝，劉元芬，李佳慧，張奕婷，王勇

(1江蘇建康職業學院臨床與護理學院，南京211800；2南京大學金陵學院化學與生命科學學院；3南京大學江蘇省醫學分子技術重點實驗室)

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·論著·

唑來膦酸對結腸癌細胞株CT26增殖、凋亡的影響及其機制探討

朱勁華1，張威1，劉美輝1，劉元芬1，李佳慧2，張奕婷3，王勇3

(1江蘇建康職業學院臨床與護理學院，南京211800；2南京大學金陵學院化學與生命科學學院；3南京大學江蘇省醫學分子技術重點實驗室)

目的觀察唑來膦酸(ZOL)對結腸癌細胞株CT26增殖、凋亡及Caspase-3、p53蛋白表達的影響。方法①ZOL對CT26細胞增殖的影響觀察：將CT26細胞分為對照組和實驗組，實驗組細胞分別加入1、20、50、120、150、250 μmol/L的ZOL，對照組不加ZOL，采用MTS法測算細胞增殖率。②ZOL對CT26細胞凋亡的影響觀察：加入終濃度分別為0、1、10、100、200、300 μmol/L的ZOL孵育CT26細胞24 h，采用流式細胞術測算細胞凋亡率。③ZOL對CT26細胞中Caspase-3、p53蛋白表達的影響觀察：將CT26細胞分為實驗組與對照組，實驗組加入終濃度為200 μmol/L的ZOL，對照組不加ZOL，分別于12、24、36、48 h后采用Western blotting法檢測Caspase-3、p53蛋白。結果1、20、50、120、150、250 μmol/L的ZOL處理CT26細胞后，細胞增殖率分別為83%、68%、65%、61%、59%、55%，20、50、120、150、250 μmol/L組與1 μmol/L組相比，P均<0.05。0、1、10、100、200、300 μmol/L的ZOL作用后，CT26細胞凋亡率分別為9%、23.06%、23.73%、26.12%、27.15%，1、10、100、200、300 μmol/L組與0 μmol/L組相比，P均<0.05；實驗組加藥36、48 h后，細胞中Caspase-3、p53蛋白相對表達量高于對照組(P均<0.05)。結論ZOL可抑制結腸癌細胞存活，促進其凋亡，作用機制可能與上調Caspase-3、p53蛋白表達有關。

唑來膦酸；結腸癌；結腸癌細胞；細胞增殖；細胞凋亡；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3；p53蛋白

唑來磷酸(ZOL)主要應用于治療骨質疏松癥、變形性骨炎、惡性腫瘤骨轉移等引起的高鈣血癥和骨痛癥等[1～5]。近年研究[6～10]發現，ZOL不僅可以減輕肺癌、乳腺癌、腎細胞癌、前列腺癌骨轉移瘤導致的疼痛，減少骨質破壞，還可延長患者的生存期。結腸癌發生發展過程與細胞的惡性轉變及過度增殖有關，也受細胞凋亡減少的影響。Caspase-3是細胞凋亡的關鍵蛋白酶[11]。研究[12]表明，Caspase-3和p53在大腸癌發生、發展中發揮一定作用，與大腸癌患者的預后有關。本研究選用結腸癌細胞株CT26制作體外腫瘤模型，觀察ZOL對CT26細胞增殖、凋亡及Caspase-3、p53蛋白表達的影響，旨在探討ZOL的體外抗腫瘤作用機制。

1　材料與方法

1.1細胞、材料與儀器人結腸癌細胞株CT26(美國模式培養物集存庫)培養于DMEM培養基(含10%胎牛血清、鏈霉素100 μmol/L，青霉素100 U/mL)，置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的培養箱中培養至對數生長期；唑來膦酸，Annexin-V FITC和PI雙染試劑盒，胰蛋白酶，PBS緩沖液，10×binding buffer，medium(含FBS)，裂解液，蛋白上樣緩沖液；超凈工作臺，離心機，37 ℃培養箱，倒置顯微鏡，細胞計數板，6孔板，96孔板，酶聯免疫檢測儀，流式細胞儀，SDS-PAGE電泳儀，電泳槽，轉膜儀，搖床，成像儀等。

1.2ZOL對CT26細胞增殖的影響觀察取對數生長期的CT26細胞(8×103/mL)，按每孔100 μL接種到96孔培養板中，將細胞分為對照組和實驗組。對照組加入100 μL的培養液；實驗組細胞加入終濃度分別為1、20、50、120、150、250 μmol/L的ZOL；另設1個空白組，無細胞，僅加200 μL的培養液。每組設10個復孔。培養24 h后用MTS法檢測每孔吸光度值(OD值)。細胞增殖率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.3 ZOL對CT26細胞凋亡的影響觀察加入終濃度分別為0、1、10、100、200、300 μmol/L孵育CT26細胞24 h，用含有EDTA的胰蛋白酶消化細胞獲得單細胞懸液，用預冷的PBS洗滌后，每管加入1×binding buffer重懸細胞；多聚甲醛固定，每管加入5 μL的Annexin-V FITC和500 μL的PI混勻，避光孵育15 min；以400 μL的1×binding buffer重懸細胞，流式細胞儀檢測凋亡細胞。

1.4ZOL對CT26細胞中Caspase-3、p53蛋白表達的影響觀察采用Western blotting法。將CT26細胞分為實驗組與對照組，實驗組加入終濃度為200 μmol/L的ZOL，對照組不加ZOL。分別于12、24、36、48 h后分離CT26細胞質，提取總蛋白。取20 μL的細胞質總蛋白上樣于10% SDS-PAGE膠，轉到PVDF膜；以BSA封閉1 h后割下條帶，在膜上做標記，加入GAPDH和Caspase-3、p53一抗，孵育過夜，洗膜后孵育相應二抗；用ECL顯色，曝光，計算蛋白相對表達量。

2　結果

2.1ZOL對CT26細胞增殖的影響1、20、50、120、150、250 μmol/L的ZOL處理CT26細胞后，細胞增殖率分別為83%、68%、65%、61%、59%、55%，隨著ZOL作用濃度增高，細胞增殖率下降，其中20、50、120、150、250 μmol/L組與1 μmol/L組相比，P均<0.05。

2.2ZOL對CT26細胞凋亡的影響0、1、10、100、200、300 μmol/L的ZOL作用后，CT26細胞凋亡率分別為9%、23.06%、23.73%、26.12%、27.15%，隨著ZOL作用濃度增高，細胞凋亡率上升，其中1、10、100、200、300 μmol/L組與0 μmol/L組相比，P均<0.05。

2.3ZOL對CT26細胞中Caspase-3、p53蛋白表達的影響實驗組加藥36、48 h后，細胞中Caspase-3、p53相對表達量高于對照組(P均<0.05)。詳見表1。

表1　兩組CT26細胞中Caspase-3、p53蛋白相對表達量比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

3　討論

ZOL能抑制因破骨活性增加導致的骨吸收，因其具有雙磷酸鹽結構，對骨具有較強的親和力。但是，在肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤的臨床治療中，ZOL不僅可以減輕患者骨轉移腫瘤導致的疼痛，減輕骨質破壞，還能延長患者的總生存期(OS)和無事件生存期(PFS)。對這一現象進行深入研究后，有學者發現ZOL在骨組織可通過抑制甲羥戊酸途徑，阻滯細胞周期從而誘導破骨細胞和單核細胞前體細胞凋亡，達到抑制骨吸收的目的。而在腫瘤組織中，ZOL能阻斷腫瘤細胞產生的各種刺激因子，誘導鈣離子釋放，減緩骨轉移的發生和發展，還可誘導多種腫瘤細胞發生凋亡，具有直接的體內外抗腫瘤作用。

本研究分別觀察了ZOL對CT26細胞增殖、凋亡的影響，結果發現，隨著ZOL作用濃度增高，細胞增殖率下降，其中20、50、120、150、250 μmol/L組低于1 μmol/L組；隨著ZOL作用濃度增高，細胞凋亡率上升，其中1、10、100、200、300 μmol/L組高于0 μmol/L組。這提示不同濃度的ZOL均可抑制CT26存活并誘導其凋亡，且隨著ZOL濃度增高，作用更明顯。

腫瘤的發生、發展與細胞過度增殖和凋亡減少有關。目前已明確的細胞凋亡相關信號轉導通路包括Fas/FasL通路、Caspase家族通路、細胞色素C信號轉導通路和線粒體通路。在這些信號通路中，Caspase家族通路被認為是非常重要的。Caspase-3是Caspase家族最重要的成員，可以與許多不同的底物發生反應，是多種凋亡途徑的共同下游效應部分。Caspase-3在許多組織和細胞中一般以非活性狀態的酶原形式存在，受到多種凋亡信號刺激后，剪切成有活性的c-Caspase-3蛋白從而啟動細胞凋亡[13]。p53基因在防止細胞過度增殖及保持DNA受損基因組的完整性上都有重要作用，其表達增加可直接引起細胞凋亡，也可通過調節其他凋亡相關基因表達，間接導致細胞凋亡[14～16]。為進一步研究ZOL抑制結腸癌細胞增殖、誘導凋亡的機制，我們觀察了ZOL對CT26細胞中凋亡相關蛋白表達的影響，結果發現，實驗組加藥36、48 h后，細胞中Caspase-3、p53相對表達量高于同時點對照組，提示ZOL可能是通過調節凋亡相關蛋白Caspase-3、p53從而發揮促進細胞凋亡的作用，且這種作用可能呈時間依賴性。

結合上述研究結果，我們認為，ZOL在體外能有效抑制CT26細胞增殖，并誘導細胞凋亡，ZOL的抗腫瘤機制可能是通過激活p53/Caspase-3信號通路、促進結腸癌細胞凋亡實現的。關于ZOL能否作為治療結腸癌的輔助藥物及ZOL的作用機制仍需進一步研究。

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Effects of Zoledronic acid on proliferation and apoptosis of colon carcinoma CT26 cells and its possible mechanism

ZHUJinhua1,ZHANGWei,LIUMeihui,LIUYanfen,LIJiahui,ZHANGYiting,WANGYong

(1JiangSuJianKangVocationalCollege,Nanjing211800,China)

ObjectiveTo investigate the effects of bisphosphonate zoledronic acid (ZOL) on the proliferation and apoptosis of colon cancer cell line CT26 in vitro and its effect on Caspase-3 and p53 protein expression. Methods① the effect of ZOL on the proliferation of colon cancer cell line CT26: CT26 cells were divided into the control and experimental group. The different concentrations of ZOL (1, 20, 50, 120, 150, 250 μmol/L) were added into the experimental group, and no ZOL was added in the control group. The proliferation inhibitory rate of CT26 cells was detected by MTS Colorimetry. ② the effect of ZOL on the apoptosis of colon cancer cell line CT26: CT26 cells were hatched with different concentrations of ZOL (1, 10, 100, 200 and 300 μmol/L). The apoptosis of CT26 cells was detected by flow cytometry. ③ the effect of ZOL on Caspase-3 and p53 protein expression: CT26 Cells were divided into the control and experimental group. ZOL with concentration of 200 μmol/L was added into the experimental group, and no ZOL was added in the control group. Caspase-3 and p53 protein expression was detected by Western blotting at 12, 24, 36 and 48 h after treatment. ResultsThe proliferation rates of CT26 cells treated with different concentrations of ZOL (1, 20, 50, 120, 150 and 250 μmol/L) were 83%, 68%, 65%, 61%, 59% and 55% respectively. Significant difference was found between groups treated with 20, 50, 120, 150 and 250 μmol/L ZOL and group treated with 1 μmol/L (allP<0.05). The apoptosis rates of CT26 cells treated with 0, 1, 10, 100, 200 and 300 μmol/L ZOL were 9%, 23.06%, 23.73%, 26.12% and 27.15%, respectively. Significant difference was found between groups treated with 1, 10, 100, 200 and 300 μmol/L (allP<0.05). After 36 and 48 h, the relative expression of Caspase-3 and p53 protein in the experimental group was higher than that of the control group (allP<0.05). ConclusionZOL could inhibit the growth of CT26 cells and promote its apoptosis, whose mechanism may be related to the up-regulated expression of Caspase-3 and p53 protein.

colon carcinoma; colon cancer cells; cell proliferation; apoptosis; Caspase-3; p53

江蘇省衛生廳科研項目(H201430)。

朱勁華(1973-)，女，副教授，碩士，主要研究方向為腫瘤藥物研究與開發。E-mail: zhjh7312@163.com

簡介：張威(1968-)，男，碩士研究生，副教授，主要研究方向為腫瘤藥物研究與開發。E-mail： zydzw0810@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.001

R78

A

1002-266X(2016)31-0001-03

2016-03-30)