原發性膽汁性肝硬化患者血清結締組織生長因子水平研究

樊雪強　　王彩生　　劉金濤　　薩茹拉　　孫　婧　　包雙寶

呼和浩特市第二醫院，內蒙古呼和浩特　010031

原發性膽汁性肝硬化患者血清結締組織生長因子水平研究

樊雪強王彩生▲劉金濤薩茹拉孫婧包雙寶

呼和浩特市第二醫院，內蒙古呼和浩特010031

目的 分析血清結締組織生長因子水平對于原發性膽汁性肝硬化患者肝纖維化進展的意義。方法 選擇2013年12月～2015年12月在呼和浩特市第二醫院就診的原發性膽汁性肝硬化患者133例，分為A組（臨床Ⅱ期）34例、B組（臨床Ⅲ期）58例及C組（臨床Ⅳ期）41例，分別檢測結締組織生長因子水平及肝纖維化指標［Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）、層粘連蛋白（LN）及透明質酸（HA）］，并分析其相關性。結果 與A組相比，B組及C組結締組織生長因子及肝纖維化水平顯著升高（P＜ 0.05），且C組高于B組（P＜ 0.05）。相關性分析顯示，結締組織生長因子與肝纖維化指標指標PCⅢ（r=0.497）、Ⅳ-C（r=0.787）、LN（r=0.734）、HA（r=0.736）呈正相關（P＜0.05）。結論 結締組織生長因子與肝纖維化指標有較好的相關性，是反映原發性膽汁性肝硬化患者病情進展的重要指標。

原發性膽汁性肝硬化；結締組織生長因子；肝纖維化

［Abstract］Objective To study the role of serum connective tissue growth factor（CTGF）level in liver fibrosis progression of patients with primary biliary cirrhosis.Methods From December 2013 to December 2015，133 patients with primary biliary cirrhosis who came from the NO.2 Hospital of Huhhot were divided into group A（clinical stageⅡ），group B（clinical stageⅢ），group C（clinical stageⅣ），each group had 34，58，41 cases respectively.The serum levels of CTGF and liver fibrosis indexes（PCⅢ，Ⅳ-C，LN and HA）were detected，and its correlation was analyzed.Results Compared with group A，the serum levels of CTGF and liver fibrosis indexes in group B and group Cwere significantly higher（P＜0.05），which in group C were higher than those in group B（P＜0.05）.Correlation analysis showed that CTGF levels were positive correlated with PCⅢ （r=0.497），Ⅳ-C（r=0.787），LN（r=0.734），HA（r=0.736）respectively，with statistically significant differences（P＜0.05）.Conclusion The level of CTGF has good correlation with the liver fibrosis indexes，which is the important indicator for reflecting the progress of patientswith primary biliary cirrhosis.

［Key words］Primary biliary cirrhosis；Connective tissue growth factor；Liver fibrosis

原發性膽汁性肝硬化 （primary biliary cirrhosis，PBC）是一種病因未明的慢性進行性膽汁淤積性肝臟疾病［1］。PBC發病初患者多無癥狀，隨著疾病進展可出現乏力、瘙癢和上腹部不適等。PBC患者肝功能生化指標異常［2］以堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和/或γ-谷氨酰轉肽酶（gamma glutamyltranspeptidas，γ-GGT）的升高為主，總膽紅素（total bilirubin，TBIL）升高、白蛋白 （albumin，ALB）下降、凝血酶原時間（prothrombintime，PT）延長是疾病進展的標志，可伴有血清總膽固醇（total cholesterol，TC）升高。患者診斷PBC時往往已出現明顯黃疸或發生肝纖維化、肝硬化甚至合并嚴重并發癥。PBC呈全球性分布，《原發性膽汁性肝硬化診治共識（2015）》中指出已經有一些研究證明PBC在我國并不是少見疾病，需引起廣大臨床醫師和患者高度重視。

結締組織生長因子（connective tissue growth facto，CTGF）是一種非結構性基質蛋白，能直接介導肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）活化、合成及分泌細胞外基質（extracellularmatrix，ECM）［3-4］，CTGF表達增加是纖維化發生發展的關鍵環節。本文針對PBC不同臨床分期患者CTGF及肝纖維化水平進行研究，現報道如下：

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇2013年12月～2015年12月在呼和浩特市第二醫院就診的PBC患者133例，男52例，女81例；年齡45～69歲，平均（56.99±6.37）歲。根據臨床診斷符合2000年美國肝病學會（American Association for the Study of Liver Diseases，AASLD）關于PBC的診斷建議［5］，即①ALP等反映膽汁淤積的生化指標升高；②超聲和/或膽管造影顯示膽管正常；③血清抗線粒體抗體（antimitochondrial antibody，AMA）和/或 AMA-M2亞型陽性；④對血清AMA/AMA-M2陰性者，肝組織病理學檢查符合PBC的改變。符合①+②+③或①+②+④即確診，并作為入選標準。根據PBC疾病分期標準［6］：Ⅰ期為肝功能正常的無癥狀期，Ⅱ期為肝功能異常的無癥狀期，Ⅲ期為肝功能異常的有癥狀期，Ⅳ期為肝硬化期；將PBC患者133例，分為A組（臨床Ⅱ期）34例、B組（臨床Ⅲ期）58例及C組（臨床Ⅳ期）41例。

1.2方法

所有患者均于入選后次日空腹采靜脈血5 mL，室溫靜置30min后離心，取血清留存待檢。人結締組織生長因子ELISA試劑盒，購自上海廣銳生物科技有限公司；肝纖維化系列診斷藥盒（放免藥盒），購自上海海研醫學生物技術有限公司，采用北京核儀器廠FT-613自動計算125I放免測量儀。肝纖維化檢測指標包括Ⅲ型前膠原 （precollagen-Ⅲ，PCⅢ）、Ⅳ型膠原（collage type-Ⅳ，Ⅳ-C）、層粘連蛋白（Laminin，LN）及透明質酸（hyaluronic acid，HA）。

1.3統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗；相關性分析采用Pearson相關性檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組血清CTGF水平比較

A、B、C組血清CTGF水平分別為（176.58±31.83）、（213.84±39.78）、（309.91±54.46）μg/L，方差分析顯示，三組間差異有統計學意義（P＜0.05），組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05），可認為血清CTGF水平C組＞B組＞A組。

2.2各組肝纖維化指標比較

方差分析顯示，三組間PCⅢ、Ⅳ-C、LN、HA水平差異有統計學意義（P＜0.05），且組間兩兩比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），C組＞B組＞A組。見表1。

表1　各組肝纖維化指標水平比較（ng/mL，±s）

表1　各組肝纖維化指標水平比較（ng/mL，±s）

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05；PCⅢ：Ⅲ型前膠原；Ⅳ-C：Ⅳ型膠原；LN：層粘連蛋白；HA：透明質酸

組別例數　PCⅢ　　Ⅳ-C　LN　HA A組B組C組34 58 41 F值P值20.13±3.63 24.01±4.47*26.85±4.72*#22.19 0.00 166.53±30.02 210.10±39.09*296.65±52.13*#166.63 0.00 150.95±27.21 186.76±34.74*307.84±54.10*#97.86 0.00 163.08±29.40 201.10±37.41*295.77±51.97*#110.02 0.00

2.3 CTGF與肝纖維化指標相關性分析

PBC患者CTGF水平與PCⅢ、Ⅳ-C、LN、HA均呈正相關關系（均P＜0.05）。見表2。

表2　CTGF與肝纖維化指標相關性分析

3　討論

PBC是一種和自身免疫因素相關的肝內膽汁淤積性肝病［7］，病因及發病機制現仍不明確［1］。近年來，隨著人們生活習慣、模式、環境等的變化、檢測手段、教育環境以及對疾病認知度等提高，PBC的診斷率有所升高［8］。PBC早期病理改變主要為肝內小膽管炎癥和破壞，致使膽汁排泄障礙，出現有淤膽特征的生化和臨床改變［9］。迄今為止，熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）是唯一被美國FDA批準用于治療PBC、且對PBC具有確切療效的藥物。現約有30%的PBC患者對于UDCA治療無應答，他們處在肝臟疾病迅速進展的風險當中，可發生肝纖維化、肝硬化甚至肝衰竭［10］。由于PBC發病機制及病理變化均區別于病毒性肝炎肝纖維化、肝硬化，故尋找一種方法可以對PBC患者的肝纖維化進程進行準確、便捷的判斷，以便把握治療時機進行靶向治療，在臨床上具有十分重要的意義。

肝纖維化是慢性肝損傷愈合過程中的反應，與多種病因相關［11-14］。肝纖維化是一種以ECM沉積為特點的可逆的肝損傷修復反應［15］，HSC活化起著重要的作用，是ECM的主要來源［16］。ECM合成大于降解，最終過量積聚肝內形成肝纖維化［17］。抑制HSC的激活已被建議作為慢性肝損傷和纖維化患者的有效治療手段［18］。在肝纖維化發展的過程中，CTGF介導HSC活化扮演重要角色。

1988年，Alnemdral首次對CTGF進行了描述；1991年由Bradham發現［19］。CTGF表達參與了多種器官組織的纖維化病變，HSC CTGF過度表達可致肝纖維化形成。研究證實，CTGF對 HSC產生的ECM有調節作用，并能促進HSC的遷移、增殖進而促使HSC活化。HSC激活可產生CTGF，CTGF反之又促進成纖維細胞增殖、遷移、黏附和ECM的產生，誘導肝纖維化的發生［20］。Xu等［21］認為，持續的CTGF高表達是肝纖維化得以形成和發展的主要原因。在培養的HSCs中CTGF被激活，促進HSC黏附、增殖和膠原蛋白的生產［22］。Lin等［23］開發的CTGF人血清三明治ELISA法確認，與健康組對照比較，肝纖維化患者血清CTGF水平顯著升高。汪明明等［24］發現，CTGF的表達強度與肝纖維化的程度密切相關，肝纖維化程度越高，CTGF的表達越強。

PBC、原發性硬化性膽管炎、原因不明肝病、酒精性肝病等原因導致硬化肝臟的原位雜交顯示，CTGF位于纖維變性的肝門束和纖維隔膜中、纖維性隔膜與肝實質的交界處，以及靠近纖維性隔膜的竇狀隙細胞中。Northern印跡分析顯示，與正常肝臟相比，在慢性病毒性肝炎、PBC、原發性硬化性膽管炎、原因不明的肝病、酒精性肝病等患者的硬化肝臟中，CTGF的表達水平增加6～8倍，且上升水平與肝硬化發生發展水平呈正相關。既往國內外研究成果顯示，CTGF水平下調后可顯著阻抑HSC激活、增殖及ECM的合成、分泌，并減少活化后HSC合成CTGF，緩解肝纖維化的生成及進展［25］。Zhu等［26］研究表明，CTGF序列特異性SiRNA能明顯減少HSC中Ⅲ型、Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、透明質酸等ECM的合成。大鼠實驗中，CTGF siRNA治療成為CCl4誘導的肝纖維化中HSC的特殊治療策略［27］。因而，CTGF不僅可成為一種纖維化激活狀態的生物標志，亦可作為PBC肝纖維化患者靶向治療的目標。

目前國內外評判PBC患者肝纖維化水平的主要手段有肝臟穿刺、肝纖維化四項檢測及肝彈性測定。上述檢測各有優劣：肝臟穿刺損傷較大，可出現抽樣誤差且費用較高；肝纖維化四項檢測可以反映體內任何組織的纖維化水平且受肝功能影響明顯；肝臟彈性測定的準確性受肥胖、脂肪肝、肋間隙大小等多種因素影響。故尋找一種操作簡單、特異性較高且較少受其他因素影響的檢測方法十分重要。有研究［28-30］分別研究慢性乙肝、乙肝肝纖維化及肝硬化患者與健康人群的CTGF及肝纖維化水平之間的關系，結果均顯示，肝硬化患者血清CTGF水平與肝纖維化水平顯著相關。但對于PBC此類自身免疫性肝病中CTGF水平與肝纖維化指標如PCⅢ、Ⅳ-C、LN及HA相關性的研究則鮮見報道。

本次體外實驗證實，隨著PBC患者病情進展，各組間肝纖維化指標水平顯著上升；隨著肝纖維化水平加重，CTGF水平亦呈現上升趨勢。本次實驗顯示，CTGF與肝纖維化指標有良好的相關性，是反映PBC肝纖維化進展的靈敏指標，較傳統的檢測指標更具優勢，適合在PBC肝纖維化評估中廣泛使用，并有望成為PBC患者肝纖維化的靶向治療中的關鍵環節。本實驗未來應用于臨床，有望早期評估、判斷PBC導致的肝纖維化，減少患者進入肝硬化、肝衰竭的風險，降低治療費用，提高患者生活質量，為臨床評估、治療PBC引起的肝纖維化及肝硬化提供了嶄新的思路和途徑，極具臨床潛力。

本次研究由于條件限制無肝活檢病理分析，今后可將PBC患者肝臟病理學改變與CTGF水平進行進一步研究，明確兩者之間的相關性。

［1］Selmi C，Bowlus CL，Gershwin ME，et al.Primary biliary cirrhosis［J］.Lancet，2011，377（9777）：1600-1609.

［2］Kaplan MM，Gershwin ME.Primary biliary cirrhosis［J］.N Engl JMed，2005，95（353）：126l-1273.

［3］GressnerOA，Gressoer AM.Connective tissuegrowth factor：a fibrogenic master switch in fibrogenic liver diseases［J］. Liver International，2008，28（8）：1065-1079.

［4］Gressner OA，Weiskirchen R，Gressner AM.Evolving concepts of liver fibrogenesis provide new diagnostic and therapeutic options［J］.Comp Hepatol，2007，6（7）：1-13.

［5］Heathcote EJ.Management of primary bilary cirrhosis.The Amerian Association for the Study of Liver Diseases：Practice guidelines［J］.Hepatology，2000，31（4）：1005-1013.

［6］王寶恩，張定風.現代肝臟病學［M］.北京：科學出版社，2003：366.

［7］曲鵬，張銳，付吉全，等.原發性膽汁性肝硬化患者的診療對策［J］.世界最新醫學信息文摘，2014，14（33）：175-175.

［8］陳晶，賈桂，高正軍，等.吸煙與原發性膽汁性肝硬化發病的關系研究［J］.實用肝臟病雜志，2015，18（2）：164-167．

［9］杜慧慧，張瑋.原發性膽汁性肝硬化發病機制［J］.肝臟，2012，17（1）：50-53.

［10］曹紅艷，陳凍伢，厲有名，等.188例原發性膽汁性肝硬化的臨床分析［J］.中華消化雜志，2014，34（12）：845-846.

［11］Ding BS，Cao Z，Lis R，et al.Divergent angiocrine signals from vascular niche balance liver regeneration and fibrosis［J］.Nature，2014，505（7481）：97-102.

［12］Son MK，Ryu YL，Jung KH，et al.HS-173，a novel PI3K inhibitor，attenuates the activation of hepatic stellate cells in liver fibrosis［J］.Sci Rep，2013，3（12）：324-324.

［13］Mederacke I，Hsu CC，Troeger JS，et al.Pradere JP and Schwabe RF.Fate tracing reveals hepatic stellate cells as dominant contributors to liver fibrosis independent of its aetiology［J］.Nat Commun，2013，4（7）：657-678.

［14］Chu PS，Nakamoto N，Ebinuma H，et al.C-C motif chemokine receptor 9 positivemacrophages activate hepatic stellate cells and promote liver fibrosis in mice［J］. Hepatology，2013，58（1）：337-350.

［15］Hernandez-Gea V，Friedman SL.Pathogenesis of liver fbrosis［J］.Annu Rev Pathol，2011，6（6）：425-456.

［16］Chen YX，Weng ZH，Zhang SL.Notch3 regulates the activation ofhepatic stellate cells［J］.World JGastroenterol，2012，18（12）：1397-1403.

［17］Gressner AM，Polzar B，Lahme B，et al.Induction of rat liver parenchymal cell apoptosis by hepatic myofbroblasts via transforming growth factor beta［J］.Hepatology，1996，23（3）：571-581.

［18］Shi CC，Li GM，Tong YY，et al.Role of CTGF gene promotermethylation in the developmentofhepatic fibrosis［J］. AmericanJournal of Translational Research，2016，8（1）：125-132.

［19］Ahima RS，Osei SY.Leptin signaling［J］.Physiol Behav，2004，81（2）：223-241.

［20］Higashiyama H，Yoshimoto D，Kaise T，et al.Inhibition of activin receptor-like kinase 5 attenuates bleomycininduced pulmonary fibrosis［J］.Exp Mol Pathol，2007，83（1）：39-46.

［21］Xu SW，Leask A，Abraham D.Regulation and function of connective tissue growth factor/CCN2 in tissue repair，scarring and fibrosis［J］.Cytokine&Growth Factor Reviews，2008，19（2）：133-144.

［22］Zhang X，Tan Z，Wang Y，et al.PTPRO-associated hepatic stellate cell activation playsa critical role in liver fibrosis［J］.Cell Physiol Biochem，2015，35（3）：885-898.

［23］Lin Z，Ram IM.Targeted Delivery of siRNA to Hepatocytes and Hepatic Stellate Cells by Bioconjugation［J］. Bioconjug Chem，2010，21（11）：2119-2127.

［24］汪明明，崔速南，李新立，等．結締組織生長因子的肝內表達與肝纖維化的關系［J］.中華傳染病雜志，2006，24（3）：202-204.

［25］樊雪強，陳新華，齊曉艷.靶向結締組織生長因子的siRNA對于肝星狀細胞介導肝纖維化的研究進展［J］中國醫藥導報，2012，9（35）：58-60.

［26］Zhu YH，Ren WH，Sun CG，et al.Disruption of connective tissue growth factor by short hairpin RNA inhibits collagen synthesis and extracellular mat rix secretion in hepatic stellate cells［J］.Liver Int，2008，28（5）：632-639.

［27］Brigstock DR.Strategies for blocking the fibrogenic actions of connective tissue growth factor（CCN2）：From pharmacological inhibition in vitro to targeted siRNA herapy in vivo［J］.JCell Commun Signal，2009，3（1）：5-18.

［28］劉棟，宋宏慶，田應選.血清生存素水平及結締組織生長因子對慢性乙型肝炎纖維化進展的臨床意義［J］.昆明醫科大學學報，2014，35（10）：96-99.

［29］賈茗茗.結締組織生長因子在肝纖維化診斷中的臨床意義［J］.齊齊海爾醫學院學報，2013，34（4）：524-525.

［30］葛海燕，孫業富.肝硬化患者血清CTGF、PDGF水平與HA、PIIIP水平的關系［J］.放射免疫學雜志，2013，26（1）：41-43.

Study of serum connective tissue growth factor in patients with primary biliary cirrhosis

FAN XueqiangWANG Caisheng▲LIU JintaoSA RulaSUN JingBAO Shuangbao
The No.2 Hospital of Huhhot，Inner Mongolia Autonomous Region，Huhhot 010031，China

R575.2

A

1674-4721（2016）09（b）-0100-04

2016-06-07本文編輯：程銘）

內蒙古自治區衛生和計劃生育委員會科研項目（201303108）。