聯合應用多種技術分析性別異常者

黃江平，沈 軍，曹 禹，平 原

（1.上海市公安局物證鑒定中心法醫物證學現場應用技術公安部重點實驗室，上海200083；2.上海市崇明縣公安局 刑偵大隊刑事科學技術室，上海202150）

鑒定實踐
Forensic Practice

聯合應用多種技術分析性別異常者

黃江平1，沈 軍2，曹 禹1，平 原1

（1.上海市公安局物證鑒定中心法醫物證學現場應用技術公安部重點實驗室，上海200083；2.上海市崇明縣公安局 刑偵大隊刑事科學技術室，上海202150）

目的 對1例Amelogenin基因座分型結果為“X，Y”的“女性”進行分子遺傳學分析。方法 采用PCR-STR技術檢測Y-STR和X-STR基因座，實時熒光定量PCR技術檢測SRY基因，原位熒光雜交（FISH）技術分析外周血細胞性染色體情況。結果 采用Y-filer試劑盒僅檢見短臂上的4個Y-STR基因座，AGCU X19試劑盒的19個X-STR基因座全部檢出，但均為純合子；SRY基因檢測為陽性；外周血細胞FISH檢測結果顯示只有一條X染色體。結論 推斷該個體是伴有Y染色體物質隱匿嵌合的Turner綜合征患者。在法醫物證檢驗中，應重視該類社會性別與Amelogenin基因座檢測結果不符的特殊個體，防止發生性別誤判。

法醫遺傳學；Turner綜合癥；FISH技術；PCR-STR技術；實時熒光定量PCR技術；X-STR；Y-STR；SRY基因

性別鑒定是法醫物證鑒定工作的重要部分之一。然而，很多內源性和外源性的原因導致一些個體出現Amelogenin基因座檢測結果與其社會性別不符的情況。本文聯合應用多種技術對法醫日常檢案中遇到的1名Amelogenin基因座分型結果為“X，Y”的“女性”個體進行分子遺傳學分析，為以后的性別鑒定工作提供借鑒。

1　材料和方法

1.1簡要案情

陳某，社會性別女，為一起入室盜竊強奸案件的被害人，送檢陳某血樣做對照樣本。經調查，陳某為女性表型，有男性配偶，無子女。

1.2樣本材料

陳某血樣和陳某外周抗凝血。

1.3主要儀器和試劑

9700型PCR擴增儀（美國AB公司）；3100XL型遺傳分析儀（美國AB公司）；7500實時熒光定量PCR擴增儀（美國AB公司）；ThermoBriteTM分子雜交儀（美國Thermo Brite公司）AmpF STRR○IdentifilerTM試劑盒（美國AB公司）；Powerplex 21試劑盒（美國Promega公司）；AmpF STRR○Y-filerTM試劑盒（美國AB公司）；AGCU X19試劑盒（無錫中德美聯公司）；QuantifilerR○Duo DNA Quantification Kit（美國AB公司）；Vysis 30-161050 CEP X/Y DNA Probe試劑盒（美國Vysis公司）。

1.4基因組DNA提取

血樣采用Chelex-100法提取基因組DNA。

1.5PCR-STR檢測

1.5.1常染色體STR和Amelogenin基因座擴增

分別采用 AmpF STRR○IdentifilerTM試劑盒和Powerplex21試劑盒。使用25μL擴增體系，按說明書進行PCR擴增。PCR反應在9700擴增儀上進行。

1.5.2Y-STR擴增

采用AmpF STRR○Y-filerTM試劑盒，按說明書進行Y-STR基因座多重PCR擴增，PCR反應體積為25μL。PCR反應在9700擴增儀上進行。

1.5.3X-STR擴增

采用AGCU X19試劑盒，按說明書進行X-STR基因座多重PCR擴增，總PCR反應體積為25μL。PCR反應在9700擴增儀上進行。

1.5.4STR擴增產物的檢測

按照說明書將不同的PCR擴增產物與Hi-Di甲酰胺-內標混勻、離心，95℃變性5min，通過3100XL遺傳分析儀進行毛細管電泳，收集電泳信息，然后用基因分析軟件 GeneMapper 3.2檢測各基因座的基因型。

1.6實時熒光定量PCR技術

用QuantifilerR○Duo DNA Quantification試劑盒參照技術手冊在7500實時熒光定量PCR儀上進行TaqMan熒光探針法定量，反應體系為25μL，包括：反應混合液 12.5 μL、引物混合液 10.5 μL、DNA模板：2μL。循環參數：50°C 2 min；95°C 10min；95°C 15；60°C 1 min for 40 cycles。擴增的靶基因情況見表1。

1.7熒光原位雜交（FISH）技術

將外周血細胞沉淀在Membrane Slide 1.0 PET（德國ZEISS）玻片上涂片后置Thermo BriteTM分子雜交儀上56℃烘干2h以上；將玻片依次過70%、85%、100%酒精各1min空氣中干燥；選定雜交區域，加4μLVysis30-161050 CEP X/Y DNA Probe試劑盒X、Y探針雜交液，蓋上蓋玻片，用膠封片，置雜交儀76℃變性3min，39℃避光過夜；次日去除蓋玻片，74℃水浴中0.4×SSC洗滌2min，室溫下2×SSC/ 0.1%NP-40洗滌1 min，避光晾干；雜交區域加3.5 μL DAPI復染液。Vysis CEP X的探針位置為Xq11.1-q11.1 Alpha Satellite；Vysis CEP Y的探針位置為Yq12 SatelliteⅢ。熒光顯微鏡下觀察結果，橙色顯示為CEP X陽性，綠色顯示CEP Y陽性。

2　結果

2.1常染色體基因檢測結果

AmpF STRR○IdentifilerTM試劑盒Amelogenin基因座的分型為“X，Y”，其余15個STR基因座為雙峰或單峰，未檢見兩個以上的峰型，排除了由于外源性污染導致Amelogenin基因改變的可能。采用Powerplex21試劑盒復檢，Amelogenin基因座分型仍為“X，Y”。

表1　QuantifilerR○Duo DNA Quantification試劑盒的靶基因

2.2Y-STR檢測結果

AmpF STRR○Y-filerTM結果顯示，16個Y-STR基因座中，僅短臂上的DYS393、DYS456、DYS458、DYS19這4個基因座上有特異性產物，長臂上的14個Y-STR基因座上無特異性產物（圖1）。推測該個體應該具有部分Y染色體短臂上的遺傳物質。

2.3X-STR檢測結果

AGCU X19試劑盒的檢測結果顯示，18個XSTR基因座全部檢出，但是，所有基因座均為純合子，推測該個體只有1條X染色體。

2.4實時熒光定量PCR技術SRY基因檢測結果

用 QuantifilerR○Duo DNA Quantification Kit試劑盒檢測位于 Yp11.32的 SRY基因，結果顯示陽性。

2.5熒光原位雜交（FISH）技術外周血細胞檢測結果

外周血的所有細胞只顯示一個橙色信號，表明該個體只有一條X染色體（圖2）。

圖1　AmpF/STRR○Y-filerTM分型結果

圖2　外周血細胞性染色體檢測結果

3　討論

Turner綜合征是女性中常見的性染色體DSD（Disorder of sex development），根據細胞核型分為4類：單一型 、嵌合型 、X染色體結構異常、含Y染色體核型，其中以單一型（45，X）最為常見，而含有Y染色體核型者較少見［1］。根據FISH和X-STR檢測結果，該個體應只有一條X染色體，結合FISH、Y-STR和SRY檢測結果，推斷其為含Y染色體核型的Turner綜合征患者。含有Y染色體核型者分為兩類，一類是以獨立的Y染色體形式存在的，如45，X/46，XY、45，X/ 46，XY（大Y）、45，X/47XYY等［2］；另一類是Y染色物質隱匿嵌合到X染色體上，如李程等報道了在30例為Turner綜合征患者中，通過傳統的細胞學核型分析，患者的分型結果為45，X/46，XX、46，XX，iX（q）、46，XX，i（Xq）/47等，后對其Y染色體上的特異序列TSPY、DYZ3、SRY進行PCR擴增和原位熒光雜交FISH，3例TSPY和DYZ3均陽性，其中1例SRY陽性［3］。本文檢測的個體應該歸為第二類，Y染色體短臂上物質隱匿嵌合到X染色體上的Turner綜合征患者。發生機制可能是在減數分裂的過程中，該個體父親在精子形成過程中的第一次減數分裂階段，Yp-Xp發生易位，導致X染色體上帶有SRY和AMELY基因［4］。

SRY基因決定男性的性分化，但是本案例個體SRY基因陽性卻為女性表型。分析原因認為SRY基因雖然是睪丸決定因子的最佳候選基因，但是性別決定與分化是一個以SRY基因為主導的多個基因參與的有序調控的復雜過程，任一環節的誤差都可能造成多種多樣的性別異常。目前的研究顯示，至少有6種基因（SRY，SOX9，DAX，WT1，SF1、DAX1）參與了胚胎中性別決定的形成過程［5］。

人類的性別分為染色體性別（遺傳性別）、性腺性別、表型性別、社會性別等［6］。通常情況下，染色體性別控制著性腺性別分化，性腺性別支配著表型性別分化，表型性別又是社會性別的重要依據。若性別分化發生異常，會出現染色體性別、性腺性別、表型性別和社會性別不符。法醫物證檢驗的是染色體性別，通過檢測位于性染色體上的Amelogenin基因來確定X和Y染色體是否存在，從而進行性別判定。然而，性別分化異常如性反轉綜合癥［4］，Amelogenin缺失［7］、接受異性外周血造血干細胞和骨髓移植［8］、大量輸入異性血液、腫瘤組織［9］、變性手術等，都可能會導致物證的Amelogenin基因檢測結果與犯罪嫌疑人的社會性別不符。

因此，應該對性別鑒定中可能會出現性別誤判的情況引起重視，慎重對待每一份檢材的性別分型結果。因而，法醫性別鑒定結果可以作為偵查破案的重要依據，但不是唯一依據。

［1］賴力，薛士杰，金靜君.1例Turner患者Amelogenin和STR基因座分型及核型分析［J］.中國法醫學雜志，2011，26（6）：485-486.

［2］陳東曉，陳懿青，陳慎仁.特納綜合征30例核型及臨床分析［J］.中國實用內科雜志，2005，25（6）:518-519.

［3］李程，程茜，鄧兵，等.Turner綜合征Y染色體物質嵌合分子遺傳學研究［J］.中國實用兒科雜志，2010，25（9）:705-708.

［4］付姣.SRY、SOX 9、DAX-1基因與性反轉綜合征的研究進展［J］.中國優生及遺傳學雜志，2009，17（3）:7-9.

［5］江靜，傅曼芬，王偉，等.Turner綜合征的實驗臨床綜合研究［J］.中國優生與遺傳雜志，2005，13（11）:48-50.

［6］趙剛，彭惠民.醫學遺傳學教程［M］.北京：科學出版社，2005:22-24.

［7］Yong R Y Y，Gan L S H，Chang Y M，et al.Molecular Characterization of a Polymorphic 3-Mb Deletion at Chromosome Yp11.2 Containing the AMELY Locus in Singapore and Malaysia Populations［J］.Hum Genet，2007，122（3-4）:237-249.

［8］周懷谷，平原，顧麗華，等.骨髓移植引出的個體識別問題［J］.法醫學雜志，2003，19（4）:228-230.

［9］劉開會，王占海，季安全，等.腫瘤組織9個STR基因座及Amelogenin基因座突變［J］.中國法醫學雜志，2002，17（2）:81-84.

（本文編輯：李成濤）

Application of Multiple Techniques in Analyzing Turner Syndrome Patient

HUANG Jiang-ping1，SHEN Jun2，CAO Yu1，PING Yuan1
（1.Key Laboratory of Forensic Evidence and Technology，Ministry of Public Security，Institute of Forensic Science，Shanghai Public Security Bureau，Shanghai 200083，China；2.Public Security Bureau of Chongming District，Shanghai 202150，China）

Objective To investigate the reason of sexual divergence，a female whose genotype of Amelogenin gene locus was“X，Y”，was further analyzed by molecular genetics.Methods We detected Y-STR locus and X-STR locus by PCR-STR technique，amplified SRY gene by real-time fluorescent quantitative PCR，and analyzed the peripheral blood sex chromosome by fluorescence in situ hybridization（FISH）.Results Using the AmpF/STR IdentifilerTM Kit，the individual showed only four profiles of Y-STR loucs locating on the p arm of the Y chromosome.With the AGCUX19 Kit，a full homozygous X profile was obtained.Detection of SRY gene got positive results.FISH analysis of peripheral blood cell showed only X.Conclusion We inferred that the individual suffered from Turner syndrome with Y chromosome material.Thus，the forensic relevance of the possible misinterpretation（sex is not necessarily social gender）should not be underestimated.

forensic genetics；Turner syndrome；FlSH；PCR-STR；real-time fluorescent quantitative PCR；X-STR；Y-STR；SRY gene

DF795.4

Adoi:10.3969/j.issn.1671-2072.2016.05.006

1671-2072-（2016）05-0037-04

2016-04-28

上海市科學技術委員會科研計劃項目（14JG0500400）

黃江平（1984—），女，主檢法醫師，碩士，主要從事法醫物證學研究。E-mail:183689284@qq.com。

平原（1970—），男，主任法醫師，碩士，主要從事法醫物證DNA分析技術的應用和研究。

E－mail：pingyuan803@163.com。