春劍花梗離體培養研究

李燦 王永清

摘要[目的]研究一種或多種適合春劍（Cymbidum longibracteatum）愈傷組織誘導的方法，并試圖找到有效控制褐化的措施。[方法]以春劍花梗為外植體進行離體培養，通過正交設計研究不同基本培養基及激素配比對花梗培養時褐化、生長和愈傷組織發生的影響；同時研究不同防褐化處理對花梗切段褐化率的影響。[結果]不同基本培養基及激素配比對花梗培養的影響顯著，不同處理方式對花梗褐化控制效果顯著。花梗切段愈傷組織誘導的最佳配方為B5+2，4D 2.0 mg/L+TDZ 0.6 mg/L +GA30.5 mg/L，誘導率為7.32%。當花芽長度為2.0 cm時，花梗褐化率較低；當花梗切割厚度為8.0 mm時，花梗褐化率較低；PVP、VC、CA、8HQS對花梗切段褐化均有顯著的抑制作用，其中以8HQS效果最好。[結論]建立了春劍花梗離體培養技術體系，為春劍快速繁殖和遺傳育種奠定基礎。

關鍵詞春劍；花梗；離體培養；愈傷組織誘導；褐化

中圖分類號S604+.3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2016）04-178-05

Study on in vitro Culture of Peduncle in Cymbidium longibracteatum

LI Can， WANG Yongqing* （College of Landscape Architecture， Sichuan Agricultural University， Chengdu， Sichuan 611130）

Abstract[Objective] The aim was to find the best way of callus induction for Cymbidium longibracteatum and the effective measures for browning control. [Method] C. longibracteatum peduncle was used as explants for in vitro culture. The effects of different basic medium and hormones on browning， growth and callus induction were studied through orthogonal design， as well as effects of different browning control treatments on browning in peduncle cutting culture.[Result] Different basic culture mediums and hormone combinations had significant effects on peduncle culture， different treatments had significant controlling effects on browning. The best medium for callus induction from peduncle was B5 +2，4D 2.0 mg/L +TDZ 0.6 mg/L +GA3 0.5 mg/L， resulting in 7.32% of callus induction.When the length of flower bud was 2 cm， the peduncle had low browning rate； peduncle explants of 8 mm thickness had the lowest rate of browning； PVP， VC， Citric acid and 8HQS had significant effects on browning control， but 8HQS displayed best results. [Conclusion] The in vitro culture technology system of Cymbidium longibracteatum peduncle is established， which will lay a foundation for rapid propagation and genetic breeding.

Key wordsCymbidium longibracteatum； Peduncle； in vitro culture； Callus induction； Browning

蘭花（Cymbidium ssp.）屬于蘭科蘭花屬植物，是我國的傳統名花，包括春蘭、建蘭、蕙蘭、墨蘭、寒蘭等，其中春劍（C.longibracteatum）名品較多，為春蘭的變種，稀少而珍貴，而常規的分株繁殖很難滿足愛好者的需求。蘭花新繁殖技術的探索始于20世紀初，20世紀70年代后，國蘭的組織培養在我國興起。目前已陸續建立了建蘭、春蘭、蕙蘭、墨蘭、寒蘭等組織培養快速繁殖無性系[1-9]。然而國蘭離體培養中褐化問題較嚴重，對外植體的誘導和繼代培養造成巨大障礙。控制褐化的常用措施有取材時間、外植體成熟度[11]、母株或外植體預處理[12]、低溫處理[13]、切口封閉[5]、吸附劑和抗氧化劑[14]、熱激處理[15]、暗培養[16] ，均可在一定程度上減輕褐化影響。目前國蘭組織培養常用種子、莖尖、側芽作為外植體建立再生體系，少數蘭花用花器官、根狀莖作為外植體。通過種子萌發的無菌苗在遺傳物質方面較難保持母株的優良性狀；莖尖和側芽的取材對母株傷害較大，在名品蘭花上較難應用。花芽作為春劍較容易取得的材料，如果能從花梗建立再生體系，將對春劍的快速繁殖和遺傳育種具有重要意義。筆者以春劍的花梗為外植體，研究了不同處理方法和基本培養基及激素配比對花梗生長和愈傷組織誘導的影響，同時對春劍花梗切段培養過程中出現的褐化問題進行研究，旨在找到一種合適春劍愈傷組織誘導的材料和方法，并試圖找到有效控制褐化的措施，以期為春劍快速繁殖和遺傳育種奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料供試材料為四川農業大學園藝系脫毒中心室外種植春劍植株的花芽。

1.2方法

1.2.1外植體準備。選取健壯植株出土飽滿的花芽，在加有洗衣粉的洗滌液中浸泡5 min，用軟毛刷輕輕刷去表面污垢，流水下清洗后，剝除2～3張苞片，然后轉入超凈工作臺，用濾紙吸干水分，用75%乙醇消毒30 s，無菌水清洗4次，再用0.1%氯化汞消毒6 min，無菌水清洗5次；剝除2～3張苞片，用0.01%氯化汞消毒3 min，無菌水清洗5次。用鑷子剝除所有的苞片，用手術刀分割花芽的花梗。

1.2.2不同基本培養基及激素配比對花梗培養的影響。花梗切段培養設計了4因素（基本培養基種類、2，4D濃度、TDZ濃度、GA3濃度）4水平，采用5因素4水平正交設計表（表1）。

1.2.3不同處理對花梗切段褐化的影響。

1.2.3.1不同花芽大小（成熟度）對花梗切段褐化的影響。取出土2.0（處理①）、4.0（處理②）、6.0（處理③）、8.0 cm（處理④）長的花芽，清洗消毒后，切割花梗接種于1/2MS+6BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養基中，每瓶接種2個外植體，每個處理接種10瓶，重復3次。

1.2.3.2不同切割厚度對花梗切段褐化的影響。將分離好的花梗進行切割，節段厚度為2.0（處理①）、4.0（處理②）、6.0（處理③）、8.0 cm（處理④），分別接于1/2MS+6BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養基中，每瓶接種2個外植體，每個處理接種10瓶，重復3次。

1.2.3.3不同浸泡液對花梗切段褐化的影響。將花梗切段分別浸泡于200 mg/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（處理①）、200 mg/L 抗壞血酸（VC）（處理②）、200 mg/L檸檬酸（CA）（處理③）、200 mg/L 8羧基哇琳硫酸鹽（8HQS）（處理④）、無菌水（處理⑤，CK）中；振蕩24 h，分別接于1/2MS+6BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養基中，每瓶接種2個外植體，每個處理接種10瓶，重復3次。

1.3培養條件除培養溫度試驗外，其他材料培養溫度為（25±2）℃，空氣相對濕度為70%～75%，光照強度為1 500～2 000 lx，光照時間為16 h/d。培養基蔗糖濃度30.0 g/L，瓊脂粉7.5 g/L，pH 5.5。

1.4數據統計與分析試驗數據采用Excel和DPS版統計分析軟件進行數據統計、方差分析及多重比較。

一級褐化率=達到一級褐化標準的外植體數未污染的外植體數×100%

二級褐化率=達到二級褐化標準的外植體數未污染的外植體數×100%

三級褐化率=達到三級褐化標準的外植體數未污染的外植體數×100%

總褐化率=褐化的外植體數未污染的外植體數×100%

轉綠百分率=轉綠的外植體數未污染的外植體數×100%

生長百分率=生長的外植體數未污染的外植體數×100%

愈傷組織誘導率=產生愈傷組織的外植體數未污染的外植體數×100%

2結果與分析

2.1不同基本培養基及激素配比對花梗切段培養的影響由表2可知，不同基本培養基及激素配比對花梗切段培養的影響顯著，處理①褐化率最低（32.75%），與其他處理間差異均不顯著；花梗轉綠百分率最高（38.11%），只與處理⑧差異顯著。

生長百分率最高（37.01%）的配方為處理⑧，同時愈傷組織誘導率也最高為7.32%。處理①對花梗切段轉綠效果最好，配方為1/2MS+2，4D 0.5 mg/L+TDZ 0.2 mg/L；處理⑧對花梗切段生長和愈傷組織發生的效果最好，配方為B5+2，4D 2.0 mg/L+TDZ 0.6 mg/L+GA3 0.5 mg/L。

方差分析表明，2，4D對花梗切段轉綠、生長、愈傷組織誘導的影響達極顯著水平。進一步對2，4D、GA3和TDZ進行多重比較，結果表明，2，4D對花梗生長和愈傷發生的影響顯著，最適濃度為2.0 mg/L；TDZ對花梗生長的影響顯著，最適濃度為0.6 mg/L；GA3對花梗切段轉綠的影響顯著，最適濃度為0.5 mg/L。

大部分花梗切段能夠通過不同激素配比的誘導轉綠，長時間培養后花梗表皮增厚，花梗切段逐漸膨大，少數外植體切口處凹凸不平，進一步培養出現少量愈傷組織，但愈傷組織很難繼續生長并增殖，在長時間的培養中，愈傷組織會逐步褐化最后死亡（圖1）。

2.2不同處理對花梗切段褐化的影響

2.2.1不同花芽大小對花梗切段褐化的影響。由表3可知，不同花芽大小對花梗切段褐化的影響顯著。2.0 cm長花芽的花梗一級褐化率最低（15.79%），隨著花芽成熟度的增加花梗褐化率隨之增加，三級褐化率也隨著花芽的增大而增加， 8.0 cm長花芽的花梗褐化率最高（29.38%）。當花芽長為2.0 cm時，花梗總褐化率最低（45.61%），當花芽長為8.0 cm時，花梗總褐化率最高（75.74%）。花梗褐化程度見圖2。

2.2.2不同切割厚度對花梗切段褐化的影響。由表4可知，不同切割厚度對花梗一級褐化率、二級褐化率影響顯著。隨著切割厚度的增加，三級褐化率逐漸減小，2.0 mm處理的花梗三級褐化率最高（78.34%），8.0 mm處理的花梗三級褐化率最低（11.99%），同時總褐化率（58.55%）也最低。不同切割厚度花梗切段生長情況見圖3。

2.2.3不同浸泡液對花梗切段褐化的影響。由表5可知，不同浸泡液對花梗切段褐化的影響顯著。用8HQS處理的外植體一級褐化率最低（10.53%），三級褐化中，CA處理的褐化率顯著高于VC和8HQS處理；4種處理的總褐化率均顯著低于對照，其中8HQS處理的總褐化率最低（36.45%）。

3結論與討論

3.1愈傷組織的發生理論上，中國蘭各種離體器官和組織都能誘導形成原球莖，再經分化培養形成植株。該試驗花梗切段誘導過程中，培養60 d后，切口處誘導出愈傷組織，誘導率為7.32%，比李子紅等[17]、曾宋君等[18]采用花芽的誘導率高。而有些未誘導出愈傷組織的外植體切口處或表皮處呈卵狀突起，深綠色，幼嫩，含水豐富，外表光滑，顏色稍淺，或表面有不規則凸凹，生長旺盛，與陳進勇等[19]、項艷等[20]的研究結果相似。

3.2不同基本培養基及激素配比對外植體培養的影響植物外植體的誘導主要受基本培養基和激素配比的影響。不同基本培養基在組織培養中的影響較大，郭翠娥[21]研究表明1/2MS培養基較適合春劍芽及根狀莖誘導，也有研究表明B5培養基有利于花蕾的培養。該試驗選用1/2MS、B5、花寶、KC作為花梗培養的基本培養基，結果發現4種基本培養基對花梗切段培養的影響均不顯著。

在原球莖的誘導階段，添加生長素如NAA和細胞分裂素對原球莖的誘導有利[22]，在一定范圍內原球莖誘導率隨著6BA濃度的增加而增大，6BA濃度在1.0～10.0 mg/L時均能誘導出原球莖，但以5.0 mg/L誘導效果最好；6BA濃度大于5.0 mg/L時，誘導率下降[23-24]，尤其是高濃度6BA會使組織嚴重褐化。該試驗中，NAA濃度對萼片的培養有顯著影響，最適濃度為1.5 mg/L；6BA濃度對花蕾的培養有顯著影響，最適濃度為1.5 mg/L。

伍成厚等[25]用蝴蝶蘭子房切段、花梗切段在2，4D 1.0 mg/L加6BA 0.1 mg/L培養基上誘導出非胚性愈傷組織，愈傷組織白色，疏松。低濃度的2，4D和NAA對花梗誘導原球莖無明顯效果，高濃度的2，4D能促進愈傷組織形成，但抑制愈傷組織形成原球莖[26]。該試驗中，2，4D對花梗愈傷組織形成具有顯著影響，最適濃度為2.0 mg/L。

TDZ誘導植物離體再生的效果顯著優于6BA[27]。周南镚等[28]指出在只有NAA的培養基中，其誘導率僅為5.8%。在 NAA、TDZ配合的培養基中皆有較高的誘導率。當TDZ濃度為0.50 mg/L時， 誘導率最高。該試驗中，TDZ對花梗的培養具有顯著影響，最適濃度為0.6 mg/L。隨著TDZ濃度的增加，誘導效果越明顯，但當TDZ濃度超過0.6 mg/L后，培養效果開始下降。

GA較少應用在國蘭的離體培養中，該研究表明，GA3對花梗切段轉綠的影響顯著，最適濃度為0.5 mg/L。

3.3不同處理對花梗切段褐化的影響Wang等[29]發現不同植物、同種植物的不同類型在組織培養中發生褐變的頻率和程度都存在很大差別，而同種植物在不同生長時期，外植體的褐化程度也有所不同，一般認為褐變隨著母株年齡增大和組織木質化程度加強而增加，處于幼齡狀態的外植體比處于成熟狀態的外植體褐變輕。該試驗取2.0、4.0、6.0、8.0 cm長花芽，剝離出花梗進行培養，發現較幼嫩花芽（2.0 cm）的花梗培養時褐化最輕，8.0 cm花芽的花梗褐化最重，與前人的研究結果一致[5]。

外植體的大小和受傷害程度影響組織培養中外植體的褐化。一般認為外植體越小，切面與體積的比率越大，傷害及褐化程度就越大[30-32]。該試驗花梗切段培養中， 2.0 mm的花梗切片太薄，切割時破壞的組織較多，外植體容易褐化死亡，褐化率達到89.6%。8.0 mm的切段褐化率較小，但外植體過大不利于營養和激素的吸收運輸，影響花梗生長和愈傷組織誘導。

該試驗中VC對花梗的褐化有較顯著的抑制作用，這與王異星[33]、彭筱娜等[34]、李麗等[35]的研究結果相似。而與張俊琦等[36]的VC在牡丹組織培養中加劇了組織培養物的褐化程度的研究結果不一致。這說明VC對不同外植體材料的防褐化效果不同。PVP的浸泡對花梗切段的褐化有顯著的抑制作用，總褐化率比對照低24.75%，與前人的研究結果相同[37-38]。CA對花梗的一級、二級褐化有顯著的抑制作用，但對外植體的三級褐化反而有加重作用，但總褐化率比對照低22.22%。研究表明CA可以有效地防止外植體的褐化[39-40]。也有研究表明CA抗褐化效果較差[38，41]，反而加劇了褐化。該試驗中8QHS對花梗的褐化抑制效果最佳，與湯浩茹等[42]的研究結果相同。4種處理對花梗總褐化率的抑制作用為CA

參考文獻

[1] 賈勇炯，曹有龍，王水.彩心建蘭花枝莖節離體培養的研究[J].四川大學學報（自然學版），2000，37（1）：94-97.

[2] 李子紅，賈燕.珍品蘭花快速繁殖與養護[M].上海：上海科學技術出版社，2006：278-284.

[3] 張志勝，歐秀娟.墨蘭的組織培養[J].園藝學報，1995，22（3）：303-304.

[4] 曾宋君，程式君，張京蔚，等.墨蘭及其雜種的組織培養與快速繁殖[J].廣西植物，1998，18（2）：l53-l56.

[5] 郭翠娥.春劍花梗離體培養中的褐化研究[D].雅安：四川農業大學，2008.

[6] 崔廣榮，劉云兵，張俊長.文心蘭組織培養的研究[J].園藝學報，2004，31（2）：253-255.

[7] 陳興貽.文心蘭的組織培養[J].植物生理學通訊，1989（6）：49.

[8] 彭曉明.文心蘭的莖尖及花梗組織培養和快速繁殖[J].園藝學報，2000，27（2）：127-129.

[9] 陳勇，林開縣，王君暉.蝴蝶蘭的快速繁殖和規模化栽培技術研究[J].浙江大學學報（理學版），2004，31（1）：84-87.

[10] 吳漢珠，王續衍，林泰碧.中國蘭莖頂組織培養研究[J].園藝學報，1987，14（3）：203-207.

[11] 張素勤.非洲菊離體快速繁殖體系的研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2002.

[12] 徐程，詹忠根，張銘，等.中國蘭的組織培養[J].植物生理學通訊，2002，38（2）：171-174.

[13] 李杰，黃敏仁.蘭花生物技術的研究及應用[J].南京林業大學學報（自然科學版），2006，30（2）：109-112.

[14]劉用生，李友勇.植物組織培養中活性炭的使用[J].植物生理學通訊，1994，30（3）：214-217.

[15] SCONDAHL M M R，MONACO L C，SHARP W R.In vitro methods applied to cofee[M]//Thorpe TA.Plant tissue culotre mehtods and applicaiton in agriculture.New York：Academic Perss，1981：325-348.

[16] 高國訊.植物組織培養中的褐變問題[J].植物生理學通訊，1999，35（6）：501-506.

[17] 李子紅，賈燕.珍品蘭花快速繁殖與養護[M].上海：上海科學技術出版社，2006：278-284.

[18] 曾宋君，程式君，張京蔚，等.墨蘭及其雜種的組織培養與快速繁殖[J].廣西植物，1998，18（2）：153-156.

[19] 陳進勇，程金水，朱瑩.幾種中國蘭種子試管培養根狀莖發生的研究[J].北京林業大學學報，1998，20（1）：32-35.

[20] 項艷，於鳳安，彭鎮華.墨蘭離體快繁研究[J].林業科學研究，2003，16（4）：434-438.

[21] 郭翠娥.春劍花梗離體培養中的褐化研究[D].雅安：四川農業大學，2008.

[22] 段金玉，謝亞紅.在無菌條件下激素和種子處理對蘭屬十種植物種子萌發的影響[J].云南植物研究，1982，4（2）：197-201.

[23] 張超，陳立思.文心蘭莖尖誘導原球莖的影響因子研究[J].廣東農業科學，2008（4）：27-31.

[24] 劉福平，洪麗萍，鄭明瓊.6BA、2，4D誘導蝴蝶蘭類原球莖外植體的研究[J].江西農業學報，2007，19（8）：69-71.

[25] 伍成厚，葉秀粦，梁承鄴.蝴蝶蘭愈傷組織誘導研究[J].亞熱帶植物科學，2004，33（4）：29-31.

[26] 李娜.蝴蝶蘭的組織培養技術研究[J].江西農業學報，2008，20（9）：51-53.

[27] 孫崇波.蕙蘭種子無菌萌發及植株再生[J].浙江農業學報，2008，20（4）：231-235.

[28] 周南镚，沈生初，黃一青.中國蘭組織培養技術[J].安徽農學通報，2006，12（5）：158 .

[29] WANG P J，HU C Y.Meristem，shoot tip and bud cultures[M]//EMVANS D A，SHARP W R，AMMIRATOPvetal（eds）.Handbook of Plant cell culture （Volum l）.New York：Ma cmillan Publiahing Co[J].A Division of Macmillan，Inc， 1983：177-228.

[30] 楊美純.外部因子對蝴蝶蘭葉片原球莖狀體發生的影響[J].廣西植物，2000，2（1）：42-46.

[31] TEIXEIRA D S，JAIME A，YAM T， et al.Establishment of optimumnutrient media for in vitro.propagation of Cymbidium Sw.（Orchidaceae） using protocormlike body segments[J].PropOrnamental Plants，2006，5（3）：129-136.

[32] 葉梅.大花蕙蘭組織培養的關鍵性技術研究[D].重慶大學，2004.

[33] 王異星.荔枝細胞培養的初步研究[J].濟南大學出版社（自然與醫學報），1997，18（5）：84-88.

[34] 彭筱娜，易自力，蔣建雄.觀賞鳳梨組織培養中防止外植體褐化的初步研究[J].湖南農業科學，2007（4）：67-69.

[35] 李麗，張湮帆，何康，等.兩種紅豆杉植物的愈傷組織培養及褐化抑制[J].復旦學報：自然科學版，2006，45（6）：701-707.

[36] 張俊琦，羅曉芳.牡丹組織培養中褐化的發生原因與防止方法的研究[J].沈陽農業大學學報，2006，37（5）：720-724.

[37] 顧福根.白萼吊鐘海棠的組織培養與快速繁殖[J].植物資源與環境學報，2006，15（3）：55-59.

[38] 張妙霞.柿樹組織培養防止外植體褐變的研究[J].河南農業大學學報，1999，33（1）：87-90.

[39] 徐程，詹忠根，張銘，等.中國蘭的組織培養[J].植物生理學通訊，2002，38（2）：171-174.

[40] 關仕港，劉建昌，崔志新，等.中國蕙蘭（金蕙）試管苗生根培養研究[J].佛山科學技術學院學報：自然科學版，2005，23（4）：66-68.

[41] 黃浩.紅豆杉細胞多酚氧化酶的性質研究初探[J].江西科學，1999，17（3）：158-162.

[42] 湯浩茹，王永清，鄧群仙.用8羥基喹啉硫酸鹽防止梨、蘋果外植體褐變[J].果樹科學，1998，15（2）：112-115.

[43] 劉均利，馬明東.華蓋木組織培養中褐化控制研究[J].浙江林業科技，2007，27（1）：20-23.

[44] 胡彥，趙艷.植物組織培養技術的應用以及在培養過程中存在的問題[J].陜西師范大學學報：自然科學，2004，32（S1）：130-134.安徽農業科學，Journal of Anhui Agri. Sci.2016，44（4）：204-205