hpRNA的制備新方法及其在RNAi載體中的應用

劉曉寧

摘要[目的]驗證制備新方法所獲得的穩定hpRNA是否可用于RNAi載體的構建并達到基因表達干擾的效果。[方法]利用制備新方法（2 μL DNA與8 μL H2O混勻，95 ℃ 5 min，37 ℃ 15 min）制備hpRNA，后采用REGS方法構建ZmMDAR RNAi載體，通過Grx1roGFP2和熒光實時定量PCR檢測基因表達干擾的效果。[結果]利用制備新方法制備50 nt hpRNA。ZmMDAR基因的表達量變化和GrxlroGFP2探針的熒光比值變化表明hpRNA介導的干擾載體引起了原生質體氧化還原狀態的變化。[結論]通過制備新方法所制備的hpRNA為RNAi載體所介導的干擾作用奠定基礎。

關鍵詞發夾RNA；REGS；ZmMDAR RNAi；Grx1roGFP2

中圖分類號Q78文獻標識碼A文章編號0517-6611（2016）04-175-03

A Prepared Method of hpRNA and Its Application for RNAi Vector

LIU Xiaoning（Medical College，Huanghe S&T College， Zhengzhou， Henan 450063）

Abstract[Objective] The aim was to test a method if it is applied for the RNAi vector and lead to interference effect. [Method] We prepared hpRNA by the new method （2 μL DNA and 8 μL H2O mixed， 95 ℃， 5 min， 37 ℃，15 min）， constructed ZmMDAR RNAi vector with REGS method， and tested the interference effect of gene expression by Grx1roGFP2 and realltime PCR. [Result] Using new method for preparing 50nt hpRNA， change of Zm MDAR expression and fluorescence ratio of GrxlroGFP2 indicated that hpRNA mediated interference vector caused the change of redox state of protoplast. [Conclusion] The prepared hpRNA by new method will lay a foundation for interference effect mediated by RNAi vector.

Key wordshpRNA； REGS； ZmMDAR RNAi； Grx1roGFP2

RNAi（RNA interference，RNA干擾）是一種進化上保守的抵御靶向細胞和病毒mRNAs的dsRNA防御機制，在此生物學過程中，小RNA干擾了mRNA轉錄本水平，從而最終抑制該基因的表達。非編碼小RNAs是miRNA和siRNA的dsRNA前體裂解產物，此裂解過程是通過一種Dicer的核酸酶執行完成。這些非編碼小RNAs與RISC[1]、AGO蛋白和其他效應子蛋白共同導致了RNA干擾。

RNAi技術日趨成為一種功能基因組研究的重要手段，Sugao等[2]使用cDNA文庫構建了RNAi文庫；Dietzl等[3]對每個基因進行單獨構建UASIR載體，然后形成RNAi文庫的方法構建了果蠅RNAi庫。此外，RNAi更有利于細胞信號轉導通路的鑒定，利用RNAi文庫靶向人類基因組中的mRNA，最終鑒定了p53信號通路的5個新調節者。構建RNAi文庫是一個相對較繁瑣的過程，迄今為止人們相繼發展了幾種構建RNAi文庫的方法：Sen等[5]利用REGS方法構建了鼠胚胎RNAi文庫；Luo等[6]利用DNA酶學工程方法構建了小鼠胚胎siRNA文庫；針對單個基因進行單獨構建，最后形成RNAi文庫[3]；Nichols等[7]以重組酶為基礎構建了能產生隨機siRNA的RNAi文庫；Wang等[8]構建了滾環復制介導的發卡RNA系統，創建了擬南芥RNAi突變體庫[9]和水稻RNAi突變體庫[10]。

發夾RNA（hpRNA）在RNAi文庫構建中起到了至關重要的作用，研究表明，在一定范圍內，短loop有利于hpRNA的形成和穩定，但loop過短會影響反向重復結構DNA分子在細菌內的克隆。當莖環比例超過6∶1時，反向重復序列便不穩定，造成缺失或重排[11]。

hpRNA的特殊結構不僅會在分子內形成莖環狀，而且還會在分子間形成二聚體。對于合適序列比例的hpRNA，如何通過合適的條件處理DNA合成公司提供的DNA干粉從而使其形成理想狀態的莖環結構，穩定hpRNA的制備條件顯得尤為重要。目前，涉及的制備方法迄今鮮見報道。

植物體內ROS（Reactive oxygen species，活性氧）的積累由2個系統控制：ROS產生和ROS清除系統。在ROS清除系統中，有酶類和非酶類抗氧化物質，酶類抗氧化物質包括MDAR、CAT、APX、GR和GPX。GSHASC循環在清除ROS中起到了重要的作用，其中，MDAR是植物體內清除ROS的主要酶類，以MDHA為反應底物，將其還原為ASC。為了驗證制備新方法所獲得的穩定hpRNA是否可以用于RNAi載體的構建并達到基因表達干擾的效果，筆者利用制備新方法制備hpRNA，采用REGS方法構建ZmMDAR RNAi載體，通過Grx1roGFP2（氧化還原敏感的綠色熒光蛋白探針）和熒光實時定量PCR檢測基因表達干擾的效果，以期為RNAi載體所介導的干擾作用奠定基礎。

1材料與方法

1.1hpRNA制備方法①配制20%非變性聚丙烯酰胺凝膠（30%聚丙烯酰胺（29∶1）27 mL，5×TBE 8 mL，定容至40 mL，加10%過硫酸銨 250 μL，TEMED 25 μL，室溫凝固時間大于1 h），配制退火溶液（10 mmol/L Tris，pH 7.5，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）；②將DNA合成公司提供的DNA干粉，溶于超純水定量為500 ng/μL；③制備方法1：2 μL DNA與8 μL H2O混勻煮沸5 min后冰上冷卻上樣；制備方法2：2 μL DNA與8 μL H2O混勻直接上樣；制備方法3：2 μL DNA與8 μL H2O混勻，95 ℃ 5 min，37 ℃ 15 min，后上樣。取不同方法制備的10 μL hpRNA，上樣。

1.2玉米材料和生長條件 選取飽滿的玉米B73種子，用3%H2O2浸泡約24 h，清水沖洗后將其播種在濕潤的蛭石中；生長條件：光周期16 h/d，溫度22 ℃；21 d后，將幼苗從蛭石中取出，盡量避免傷及根部，用清水將根部附著的蛭石沖洗干凈，水中靜置1 h以消除創傷刺激。之后取葉片。

1.3ZmMDAR的RNA干擾載體構建 按照制備新方法3制備50 nt hpRNA獲得ZmAPX的反向重復片段，采用REGS方法構建ZmMDAR RNAi載體得到9zfPubiZmMDAR RNAiTnos。

1.4原生質體的共轉化分離玉米葉肉原生質體，采用Pure YieldTM Plasmid Midiprep System提取質粒9zf（）Pubi Grx1roGFP2Tnos和9zfPubiZmMDAR RNAiTnos，濃度約1 μg/μL。將2份質粒等量混合，加入200 μL原生質體，彈勻后加入220 μL 40%PEGCa2+，室溫培養15 min，用800 μL W5洗滌2次，后加入1 mL W5重懸，輕輕混勻，平放于培養皿中過夜培養。

1.5Realtime PCR提取玉米葉片或原生質體RNA，利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）去除基因組DNA后反轉錄合成cDNA，當原生質體RNA反轉錄時，引物更換為oligo d（T）以避免隨機擴增造成的基因表達量。在Realtime PCR中，20.0 μL反應體系：8.8 μL cDNA（稀釋20倍），10.0 μL 2× SYBR premix Extaq，0.8 μL primers，0.4 μL ROX。ABI 7500儀器運行程序：95 ℃2 min；95 ℃15 s 和60 ℃34 s，共40個循環；最后進入溶解曲線階段。以GAPDH為內參基因，未處理的葉片或原生質體為對照樣品，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.6激光共聚焦顯微鏡觀察以9zf（）PubiGrx1roGFP2Tnos和9zfPubiMCSTnos混合質粒轉化的原生質體為對照，取適量9zf（）PubiGrx1roGFP2Tnos和9zfPubiZmMDAR RNAiTnos原生質體于載玻片上，在405和488 nm 2個通道中進行觀察，每個樣品中選取10個不同的原生質體細胞進行層掃拍攝。

2結果與分析

2.1hpRNA制備新方法在hpRNA制備方法中，選擇50 nt寡核苷酸（序列：GGGTTCGATCGTCACTGGCCGTCGTTTTACCAGTGACGAGTTAACCCTGC）和39 nt寡核苷酸（序列：TTGGATCCCGGTTCAAAGAGTAGTACCGGGATCCAAAGG）。通過RNA structure 5.7軟件預測了50和39 nt寡核苷酸的hpRNA，這表明在合適的制備條件下，寡核苷酸只能在分子內形成預期的結構即hpRNA，約22和18 bp（圖1），而不能在分子間形成二聚體，約50和39 bp。為了研究hpRNA的制備條件，首先配制了20%非變性聚丙烯酰胺凝膠，1 μg DNA上樣。由圖2可知，50和39 nt寡核苷酸在經方法1和方法3處理后，只有22和18 bp的產物，所獲得的hpRNA占有幾乎100%的比例，表明寡核苷酸經方法1（煮沸5 min后冰上冷卻）和方法3（95 ℃ 5 min，37 ℃ 15 min）處理，只能在分子內形成hpRNA，而不能在分子間形成二聚體。因此，在構建RNAi載體時，可以選擇方法1和方法3制備出更多比例的hpRNA。

Fig.1hpRNA predicted by RNA structure2.2ZmMDAR家族的基因為了探究ZmMDAR家族和AtMDAR家族的進化關系，將AtMDAR序列號輸入到PLAZA2.5軟件中，確定了ZmMDAR家族的2個基因（表1）。

2.3hpRNA在ZmMDAR的RNA干擾載體中的應用按照制備新方法3制備50 nt hpRNA，通過REGS方法獲得了MDAR1 RNAi和MDAR2 RNAi構建的反向重復片段（圖3）。最后，與CIP處理的9zfMCS載體連接，得到了最終的干擾載體，用于瞬時表達系統中內源基因表達變化引起的細胞氧化還原狀態改變的分析。

ZmMDAR基因的功能意味著該基因的表達下降必然引起玉米體內氧化還原狀態的改變，hpRNA介導的干擾載體是否會引起這種狀態改變有待于進一步檢測。通過質粒共轉化玉米葉肉原生質體，發現玉米原生質體中的ZmMDAR表達量下降（圖41），同時也觀察到ZmMDAR的表達量下降引起了原生質體內的氧化，相對于對照的熒光比值1.22，Grx1roGFP2探針的熒光比值均不同程度的上升（圖42a），MDAR1和MDAR1干擾載體轉化的原生質體中的熒光比值大幅度上升，約為2.62和2.60（圖42b和42c））。Grx1roGFP2探針的熒光比值變化表明hpRNA介導的干擾載體引起了原生質體氧化還原狀態的變化，同時，也表明通過制備方法3所制備的穩定50 nt hpRNA，為基因表達的干擾作用奠定了基礎。

1.全式金100 bp ladder；2.玉米APX cDNAs片段被Sfi I酶切后電泳圖；3.制備方法3獲得的50 nt hpRNA；4.MDAR cDNAs片段與50 nt hpRNA連接后，經phi29聚合酶滾環擴增；5.擴增產物經Asc I酶切，獲得單個反向重復片段；6.全式金1 kb ladder。

3結論與討論

hpRNA在RNAi文庫構建中起到了至關重要的作用，該研究利用制備方法3制備50 nt hpRNA，后采用REGS方法構建了ZmMDAR RNAi載體，通過Grx1roGFP

2探針和熒光實時定量PCR檢測基因表達干擾的效果。結果表明，通過制備方法3所制備的穩定50 nt hpRNA，為基因表達的干擾作用奠定了基礎。

在hpRNA制備方法中，該研究采用95 ℃ 5 min，37 ℃ 15 min可以獲得更多比例的預期hpRNA，然而，這些是針對較短序列而言的，對于較長序列，是否具有同樣的優化條件，需要進一步研究。

參考文獻

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