鹽酸苯海索-Ce(IV)熒光法檢測蝦中亞硫酸鹽含量

張靜,馬占玲,汪瑩,李寧寧,陳思,勵建榮

(渤海大學 化學化工與食品安全學院，遼寧省食品安全重點實驗室,遼寧 錦州,121013)

?

鹽酸苯海索-Ce(IV)熒光法檢測蝦中亞硫酸鹽含量

張靜,馬占玲*,汪瑩,李寧寧,陳思,勵建榮

(渤海大學 化學化工與食品安全學院，遼寧省食品安全重點實驗室,遼寧 錦州,121013)

基于鹽酸苯海索-Ce(IV)-亞硫酸鹽在弱酸或中性條件下反應生成強烈的熒光物質，建立了檢測食品中亞硫酸鹽含量的新方法。確定了測定亞硫酸鹽的最佳條件。在最佳條件下，亞硫酸鹽含量在0.02～1mg/mL呈現良好的線性，線性方程為：y=8 031.7x-203.31，相關系數為0.996 8，方法的檢出限為0.001μg/mL，遠低于國家標準方法——鹽酸副玫瑰苯胺法。方法的相對標準偏差為6.08%，回收率在82.4%～92.8%之間。該方法操作簡單、靈敏度高、污染??；用于測定蝦中亞硫酸鹽含量，與國標法無顯著性差異。

鹽酸苯海索；Ce(IV)；亞硫酸鹽；熒光法；蝦

亞硫酸鹽是一種常用的食品添加劑，具有漂白、防腐、抗氧化、防止褐變等作用[1-2]。蝦類制品(海捕鮮蝦，凍蝦仁，速凍小蝦，凍對蝦，烤蝦等)是亞硫酸鹽的一大應用領域。此類制品中，亞硫酸鹽能有效防止蝦體在冷凍(藏)貯存和加工過程中的褐變，防腐保鮮，保護制品的品質和色澤，延長制品的保質期[1]。但是，亞硫酸鹽具有一定的毒性，WHO規定每人每日攝入亞硫酸鹽的量應低于0.7mg[3]。攝入過量亞硫酸鹽將會導致呼吸困難、蕁麻疹、哮喘、胃腸不適等問題，尤其是對哮喘患者尤為嚴重[4-5]，過量的亞硫酸鹽還會對人體的神經系統、生殖系統、循環系統、免疫系統等帶來一定的危害[6-8]?；趯喠蛩猁}毒性的認識，各國均對食品中SO2殘留量做出了嚴格的限定，國際食品法典委員會(CAC)明確規定了冷凍蝦中SO2殘留量，在生品可食性部分≤100mg/kg，熟食可食性部分≤30mg/kg[9]。目前我國檢測食品中亞硫酸含量的方法主要有國標法中采用的鹽酸副玫瑰苯胺比色法和蒸餾滴定法[10]，其他方法如色譜法[11]、化學發光法[12]、電化學法[13]、傳感器法[14]等，但均有各自的不足。如鹽酸副玫瑰苯胺比色法使用大量劇毒試劑四氯汞鈉，對環境和人體造成損害，同時食品中含量較高的離子如Cl-對方法的干擾較大，蒸餾滴定法操作復雜，不適合大批量樣品的檢測。

基于鹽酸苯海索能顯著增強Ce(IV)與亞硫酸鹽之間化學發光反應[15]，本文建立了一種檢測水產品中亞硫酸鹽含量的新的熒光法，與鹽酸副玫瑰苯胺比色法相比，該方法污染性小，干擾低，檢測限低，與蒸餾滴定法相比，操作簡單、檢測速度快、適合大批量樣品檢測。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

KQ-250DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；PL303電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；970CRT熒光分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司；RRHP-100型萬能高速粉碎機，歐凱萊芙實業公司；UV-1801紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司。

硫酸鈰、鹽酸苯海索、NaOH、Na2SO3均為分析純，購自國藥集團。

1.2樣品處理與檢測

1.2.1樣品處理

樣品經粉碎機粉碎均勻后，準確稱取2.5g樣品粉末，置于50mL容量瓶中，加入2.5mLNaOH溶液，再加入適量蒸餾水，超聲1.5h后定容，取濾液備用。

1.2.2樣品檢測

向比色管中加入2mLCe(SO4)2(0.01mol/L)，2mL鹽酸苯海索(0.020mg/mL)、1mL樣液，去離子水定容到20mL。搖勻，35℃條件下反應15min，在激發波長為265nm，發射波長為350nm，狹縫為10nm條件下進行熒光測定。

2　結果與討論

2.1單因素實驗條件的選擇

2.1.1最大發射波長的確定

在最佳條件下，鹽酸苯海索-亞硫酸根-硫酸鈰進行反應，在200～800nm內進行發射光譜掃描，結果見圖1，從而確定該反應體系的熒光發射波長為350nm。

圖1　EM掃描熒光光譜 Fig.1　Chart of EM scanning fluorescence spectra

2.1.2鹽酸苯海索用量的影響

當其他條件一定時，考察了20mg/L鹽酸苯海索的用量對實驗結果的影響，結果見圖2。由圖2可見，熒光強度隨著鹽酸苯海索用量的增加先變小后變大，鹽酸苯海索用量為2.0mL時，熒光強度較大且比較穩定。本實驗選擇鹽酸苯海索用量為2.0mL。

圖2　鹽酸苯海索用量對反應體系的影響Fig.2　Effect of trihexyphenidyl hydrochloride dosage on chemical reaction system

2.1.3硫酸鈰用量的影響

探討了0.01mol/L硫酸鈰的用量對實驗結果的影響，結果如圖3所示。當其他條件一定時，隨著硫酸鈰用量的增加，熒光強度不斷變大?？梢娫谠摲磻w系中，熒光強度與硫酸鈰和亞硫酸鹽均有關，但在硫酸鈰用量一定的條件下反應體系的熒光強度與亞硫酸鹽成正比，考慮到實驗條件，本實驗確定Ce(SO4)2用量為2.0mL。

圖3　Ce(SO4)2用量對反應體系的影響Fig.3　Effect of Ce(SO4)2 dosage on chemical reaction system

2.1.4反應溫度的影響

當其他條件一定時，考察了溫度對實驗結果的影響，結果如圖4所示。由圖可見，熒光強度隨著溫度的升高先變小后變大，當反應溫度為35 ℃時，熒光強度達到最大值。本文確定反應最佳溫度為35 ℃。

圖4　反應溫度對反應體系的影響Fig.4　Effect of reaction temperature on chemical reaction system

2.1.5反應時間的影響

考察了時間對實驗結果的影響，結果如圖5所示。當其他條件一定時，反應時間對實驗結果的影響不大。綜合考慮，本文選擇反應時間為15min。

圖5　反應時間對反應體系的影響Fig.5　Effect of reaction time on chemical reaction system

2.2反應條件的正交實驗

在單因素的基礎上，對鹽酸苯海索用量、Ce(SO4)2用量、反應溫度、反應時間進行4因素4水平正交實驗L16(45)。表1為正交實驗因素水平表。表2和表3為正交實驗結果表。

表1　正交實驗因素水平表L16(45)

表2　正交實驗結果及計算表L16(45)

通過極差分析可知，各因素對熒光強度(I)的影響順序為：Ce(SO4)2用量B>反應溫度C>鹽酸苯海索用量A>反應時間D。熒光法檢測食品中亞硫酸鹽含量的最佳條件為：A4B4C4D3，即鹽酸苯海索用量為2.0mL，Ce(SO4)2用量為2.0mL，反應溫度為35 ℃，反應時間為15min。

方差分析結果表明，Ce(SO4)2(B)達到極顯著水平，對熒光強度影響較大。其他因素對鹽酸苯海索用量、反應溫度、反應時間均未達到顯著水平，對實驗結果影響不大。

2.3共存離子的影響

在亞硫酸鹽濃度為0.8g/L，相對偏差小于±5.0%時，干擾離子所允許的共存倍數為Na+(200倍)、Cl-(200倍) 、K+(200倍)、NO22-(100倍)、Zn2+(100倍)、蛋白質(100倍)、Vc(5倍)、PO43-(100倍)，由此可見，該體系對亞硫酸鹽的選擇性較好。

表3　方差分析表

2.4方法評價

2.4.1工作曲線

取系列亞硫酸鹽標準溶液，在最佳條件下反應15min后，在激發波長為265nm，發射波長為350nm下測定熒光強度，繪制工作曲線。實驗結果表明，亞硫酸鹽含量在0.02～1mg/mL熒光強度與濃度成正比，其線性回歸方程為y=8031.7x-203.31，相關系數R為0.996 8，呈很好的線性關系。

2.4.2方法的檢出限

使用空白溶液連續測量15次，利用公式(1)計算出本方法的最低檢出限：

DL=3σ/k

(1)

式中：σ，標準偏差；k，工作曲線斜率。

經15次測量空白溶液，其標準偏差為3.48，工作曲線的斜率為8 031.7，計算方法檢出限為0.001μg/mL，低于國標法鹽酸副玫瑰苯胺的檢測限0.1μg/mL(即1mg/kg，按10g樣品定容100mL計)?？梢娫摲椒ǖ臋z出限低，靈敏度高，能較好地適應蝦中亞硫酸鹽的檢測。

2.4.3方法的精密度和回收率

取凍蝦用粉碎機攪碎，準確稱取5.00g，移入容量瓶中，加入2.5mLNaOH溶液，再加入少量水將樣品浸沒，超聲90min之后，測定其中亞硝酸鹽含量，平行測定5次，計算其相對標準偏差。然后分別加入不同量的亞硫酸鹽，測定回收率。結果如表4所示，由實驗結果可見，相對標準偏差為6.08%，平均回收率在82.4%～92.8%之間。精密度和準確度均能達到實驗要求。

表4　方法精密度和回收率

2.4.4與國標法差異性檢驗

分別用本法與國標法檢測凍蝦中亞硫酸鹽的含量，平行測定5次，結果如表5所示。

用F檢驗法和t檢驗法對國標法和熒光法測得的凍蝦中亞硫酸鹽含量的平均值顯著性差異進行檢驗。通過計算F為1.05，小于F0.95,4(6.39)，說明二者的方差不存在顯著性差異(P<0.05);t值為1.27，小于t0.95,8(2.31)，說明2種方法測得的平均值，即2種方法無顯著性差異(P<0.05)。

表5　熒光法與國標法顯著性差異比較

2.5樣品檢測

在市場買取5份不同的凍蝦進行測量，測得結果見表6。結果表明5種凍蝦中亞硫酸鹽的含量在82.33～121.35mg/kg。其中有一種樣品中亞硫酸鹽含量超過中華人民共和國水產行業標準SC/T3113—2002規定的冷凍蝦中SO2殘留量≤100mg/kg的限量，其他4種樣品合格。

表6　樣品測定

3　結論

建立了鹽酸苯海索熒光光度法檢測食品中亞硫酸鹽含量的新方法。與國標法中的鹽酸副玫瑰苯胺比色法相比較，該方法未使用劇毒試劑，環境污染小，海產品中含量較大的離子如Cl-對方法的干擾較小，檢測更快速；檢出限低，適合大批量樣品的檢測。該方法用于凍蝦中亞硫酸鹽含量的檢測，效果較好。

[1]張雙靈, 趙奎浩, 周德慶,等. 水產品中亞硫酸鹽的安全性及殘留狀況檢測[J]. 現代食品科技, 2007, 23(3):60-62.

[2]AMATATONGCHAIM,SROYSEEW,CHAIRAMS,etal.Simpleflowinjectionfordeterminationofsulfitebyamperometricdetectionusingglassycarbonelectrodemodifiedwithcarbonnanotubes-PDDA-goldnanoparticles.[J].Talanta, 2015, 133:134-141.

[3]KOCHM,KOPPENR,SIEGELD.Determinationoftotalsulfiteinwinebyionchromatographyafterin-sampleoxidation[J].JournalofAgricultural&FoodChemistry, 2010, 58(17):9 463-9 467.

[4]RANGUELOVAK,RICEAB,LARDINOISOM,etal.Sulfite-mediatedoxidationofmyeloperoxidasetoafreeradical:immuno-spintrappingdetectioninhumanneutrophils[J].FreeRadicBiolMed, 2013, 60(10):98-106.

[5]WUMY,HET,LIK,etal.Areal-timecolorimetricandratiometricfluorescentprobeforsulfite[J].Analyst, 2013, 138(10):3 018-3 025.

[6]SANGN,YUNY,LIH,etal.SO2inhalationcontributestothedevelopmentandprogressionofischemicstrokeinthebrain[J].ToxicologicalSciences, 2010, 114(2):226-236(11).

[7]劉東奇, 陳華成, 楊雪麗. 二氧化硫對機體各組織器官毒性作用的研究進展[J]. 畜牧獸醫雜志, 2008, 27(1):37-39.

[8]李雪蓮, 楊麗, 陳鴻平,等. 食品中亞硫酸鹽研究進展[J]. 亞太傳統醫藥, 2015, 11(3):34-37.

[9]高平, 黃國方, 胡瓊予,等. 淺議蝦類產品標準中亞硫酸鹽限量問題[J]. 當代水產, 2009(11):31-32.

[10]GB/T5009.34-2003.食品中亞硫酸鹽的測定[S].

[11]ABERLA,COELHANM.Determinationofsulfurdioxideinwineusingheadspacegaschromatographyandelectroncapturedetection.[J].FoodAdditContamPartAChemAnalControlExpoRiskAssess, 2013, 30(2):226-233.

[12]NAVARRROMV,MARARAMOSPAYN,MIGUELANGELBELLOLPEZ,etal.Rapidflowinjectionmethodforthedeterminationofsulfiteinwineusingthepermanganate-luminolluminescencesystem.[J].Talanta, 2010, 82(5):2 003-2 006.

[13]FULM,JUWJ,LIUCC,etal.IntegratedmicrofluidicarraychipandLEDphotometersystemforsulfurdioxideandmethanolconcentrationdetection[J].ChemicalEngineeringJournal, 2014, 243(5):421-427.

[14]SARTORIER,VICENTINIFC,FATIBELLO-FILHOO.Indirectdeterminationofsulfiteusingapolyphenoloxidasebiosensorbasedonaglassycarbonelectrodemodifiedwithmulti-walledcarbonnanotubesandgoldnanoparticleswithinapoly(allylaminehydrochloride)film[J].Talanta, 2011, 87(2):235-242.

[15]張涇凱,李建國,屠一鋒. 鈰(Ⅳ)-亞硫酸鹽體系流動注射化學發光法測定苯海索新方法研究[J]. 蘇州大學學報：自然科學版, 2009, 25(3):68-71.

Fluorescencedeterminationofsulfiteinshrimpwithtrihexyphenidylhydrochloride-Ce(IV)systym

ZHANGJing,MAZhan-ling*,WANGYing,LINingning,CHENSi,LIJian-rong*

(CollegeofChemistry,ChemicalEngineeringandFoodSafety,BohaiUniversity,FoodSafetyKeyLabofLiaoningProvince,Jinzhou121013,China)

Strongfluorescentsubstancesweregeneratedbasedontrihexyphenidylhydrochloride-Ce(IV) -sulfiteundertheconditionsofweakacidorneutral.Anewdeterminationmethodofsulfitesinshrimpwasestablished.Thefluorescenceintensityandtheconcentrationofsulfite(SO2)showedgoodlinearityintherangeof0.02～1mg/mL,theregressionequationisy=8 031.7x～203.31.Thecorrelationcoefficientis0.999 6.Themethoddetectionlimitis0.001μg/mL.Itisfarlowerthanthatofthenationalstandard.Therelativedeviationofthesampleis6.08%andtherecoveryrateisbetween96%and107%.Themethodissimple,sensitive,andenvironmentallyfriendlyandtheresultwassatisfying.Theresultcomparingwiththestandardmethodisbasicallythesame.

trihexyphenidylhydrochloride;Ce(IV);sulfite;fluorescencespectrometry;shrimp

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608032

碩士研究生(馬占玲教授，勵建榮教授為通訊作者，E-mail分別為：13898355801@sina.com和lijr6491@163.com)。

“十二五”國家支撐計劃項目課題“水產品加工過程質量安全控制關鍵技術集成與示范”(No. 2012BAD29B06)

2015-12-30，改回日期：2016-02-22