高效液相色譜法測定櫻桃汁及不同釀酒酵母所釀櫻桃酒的活性成分

呂國濤，牛宇，單璐，冀佩雙，張麗珍*

1(山西大學 生命科學院，山西 太原， 030006)　2(山西省農業科學院 農業資源與經濟研究所，山西 太原， 030006)

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高效液相色譜法測定櫻桃汁及不同釀酒酵母所釀櫻桃酒的活性成分

呂國濤1，牛宇2，單璐1，冀佩雙1，張麗珍1*

1(山西大學 生命科學院，山西 太原， 030006)2(山西省農業科學院 農業資源與經濟研究所，山西 太原， 030006)

以As2399、grapeZ2、WineZ3 三種釀酒酵母對櫻桃果汁進行發酵釀造的櫻桃酒為研究對象，利用高效液相色譜法對3種櫻桃酒和櫻桃果汁的酚酸類化合物、黃酮類化合物、有機酸類化合物進行分析比較。結果表明，所檢測的各酚酸、黃酮、有機酸均呈現良好的線性關系(R2>0.992)，不同水平的添加回收率為91.93%～106.82%。4種樣品分析表明，篩選的較優釀酒酵母是As2399。櫻桃酒中總酚酸與總黃酮的含量均比櫻桃果汁中減少。4種樣品總酚含量依次為果汁>As2399>WineZ3>grapeZ2；總黃酮含量依次為果汁>As2399>WineZ3>grapeZ2。櫻桃酒中的綠原酸、咖啡酸、香草酸、p-香豆素和阿魏酸的含量均顯著高于櫻桃果汁，As2399櫻桃酒中p-香豆素的含量顯著高于另2種櫻桃酒。櫻桃酒與櫻桃果汁中的蘆丁、白藜蘆醇、槲皮素、山奈酚含量無顯著差異，在As2399櫻桃酒檢測到了黃芩素。3種櫻桃酒中酒石酸、蘋果酸、檸檬酸含量均比櫻桃果汁中增加,草酸含量均比櫻桃果汁減少；草酸、檸檬酸、富馬酸在3種櫻桃酒中無顯著差異，As2399櫻桃酒中酒石酸、檸檬酸與琥珀酸含量較另2種櫻桃酒高。

櫻桃酒；活性成分；高效液相色譜法；釀酒酵母

櫻桃(cherry)屬薔薇科(Rosaceae)李屬(PrunusL．)喬木，櫻桃果實較其他落葉果樹果實成熟較早。其果實甜美，多汁爽口，富含大量的糖類、維生素、蛋白質、可溶性固形物及鈣、鐵、鉀等物質[1]?？紤]到櫻桃不易儲存的原因，可對櫻桃進行一些加工處理，目前廣泛利用櫻桃進行櫻桃酒的釀造。櫻桃酒中含有大量的酚酸、黃酮、有機酸類化合物。

酚類物質作為植物體中重要的次生代謝產物，對植物生長發育起著重要作用，多酚物質是判斷果酒存在差異性的主要原因之一，不僅決定著果酒澀味和苦味的優劣與強弱，還影響著原果的色澤、貯藏壽命及生物化學穩定性[2]。黃酮類物質作為自然界存在的酚類化合物中最大的一類，其功效眾多，是一種強抗氧劑，能夠有效清除體內的氧自由基，大部分單寧是由黃酮類化合物轉變而來的[3-4]。有機酸是一類含有羧基的化學物質，具有增加冠脈流量、抑制腦組織脂質過氧化物生成、抗突變和抗癌等作用，作為果酒中主要的營養物質之一，其含量的高低與酒制品的品質和保健功能有著極其密切的關系[5-8]。

隨著生活節奏的加快，人們越來越重視食品的營養價值及其保健功能，人們對酒類的消費要求也逐漸發生了變化，消費趨勢由高度酒轉變為低度酒，開發櫻桃酒具有重要意義。目前國內外對與櫻桃酒中的酚酸、黃酮、有機酸及揮發性成分的定量定性研究甚少[9-10]。本文以As2399、grapeZ2、WineZ3 3種釀酒酵母對櫻桃果汁進行發酵釀造的櫻桃酒為研究對象，利用高效液相色譜技術(HPLC)對3種不同發酵方式所得櫻桃酒的活性物質與櫻桃果汁進行了分析與對比，為櫻桃酒的風味評價和生產工藝優化提供可靠的科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

櫻桃(品種‘紅瑪瑙’)，采收于山西省農業科學院果樹研究所；釀酒酵母由天津科技大學饋贈；標準品沒食子酸、咖啡酸、綠原酸、阿魏酸、香草酸、p-香豆酸(純度：97.5%～102.5%) 西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；標準品蘆丁、槲皮素、白藜蘆醇、山奈酚、黃芩素、漢黃芩素北京世紀奧科生物技術有限公司(純度≥98%)；標準品草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸(純度≥90.8%) 上海阿拉丁試劑公司；乙腈(色譜純) 天津市四友精細化學品有限公司；甲醇(色譜純) 天津市大茂化學試劑廠；冰醋酸(色譜純) 天津市化學試劑三廠；福林酚北京索萊寶寶科技有限公司；乙醇(95%)、磷酸(96%)、硼氫化鈉、AlCl3、Na2CO3、氯醌、香草醛、三氟酸、四氫呋喃(99%)、鹽酸均為市售分析純；試驗中所用水均為超純水。

1.2儀器與設備

U3000型戴安高效液相色譜儀；ME204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產品；InfiniteM200PRO全波長多功能微孔板檢測儀，帝肯公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市環宇科技儀器廠。

1.3實驗方法

1.3.1櫻桃酒的釀造

1.3.2酚酸類化合物的分析

1.3.2.1總酚含量的測定

總酚含量的測定采用福林-酚法[11-12]。在試管中加入樣品液(或標準溶液)、福林酚試劑各100μL，再加入400μL去離子水，充分振蕩反應6min。后加0.8mL超純水和1mL7%的Na2CO3溶液，混勻于室溫進行黑暗反應90min后于760nm處測吸光度值?？偡雍恳詻]食子酸含量mg/L表示。

1.3.2.2酚酸類化合物的定量定性檢測

混合標準品的制備：稱取0.5mg各酚酸的標準品，溶于1mL流動相中，混合各酚酸標準品的母液，得到混合標準品，通過控制進樣量的多少來改變各標準品的濃度，建立各酚酸的標準曲線。

色譜條件：C18色譜柱(4.6mm×150nm，5μm)；柱溫30 ℃；流動相為V(乙腈)∶V(超純水)=2∶8,pH=3.0；流速0.5mL/min；進樣量10μL；紫外檢測波長280nm。

1.3.3黃酮類化合物的分析

1.3.3.1總黃酮的測定

總黃酮含量的測定采用硼氫化鈉/氯醌法[13-14]。將樣品(或槲皮素標準液)1mL置于試管中，加入0.5mL硼氫化鈉和0.5mLAlCl3室溫振蕩30min，之后加入0.5mL硼氫化鈉室溫振蕩30min。將2mL乙醇充分混合后避光處理振蕩15min。加入1mL氯醌95 ℃水浴60min。自來水冷卻，用甲醇定容至4mL，加入1mL香草醛，搖勻后加入2mL濃鹽酸，室溫黑暗反應15min后2 500r/min離心3min。取200μL上清液于490nm處檢測其吸光值。總黃酮含量以槲皮素含量(g/L)表示。

1.3.3.2黃酮類化合物的定量定性檢測

混合標準品的制備：稱取1mg各黃酮的標準品，溶于1mL流動相中, 之后同1.3.2.2。

色譜條件：C18色譜柱(4.6mm×150nm，5μm)；柱溫30 ℃；流動相：A為10%乙腈水溶液(含0.2%乙酸)，B為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(超純水)=2∶2∶1(含0.2%乙酸)；流速0.5mL/min；進樣量10μL；紫外檢測波長360nm[15]；梯度洗脫程序見表1。

表1　梯度洗脫程序

1.3.4有機酸類化合物的定量定性檢測

混合標準品的制備：稱取1mg各有機酸的標準品，溶于1mL流動相中, 之后同1.3.2.2。

色譜條件：C18色譜柱(4.6mm×150mm，5μm)；柱溫55 ℃；流動相為0.05mol/LV(磷酸)∶V(甲醇)=95∶5； 流速0.7mL/min；進樣量10μL；紫外檢測波長230nm[16-18]。

1.3.5添加回收率計算[公式(1)]

(1)

式中：X為標準品與樣品混合后測定某項指標的含量，mg/L；Y為樣品中某項指標的含量，mg/L；Z為某項標準品含量，mg/L。

2　結果與分析

2.1酚酸類化合物的檢測分析

2.1.1總酚含量測定

總酚含量的測定以沒食子酸為參照，橫坐標為沒食子酸的濃度(mg/L)，縱坐標為對應吸光度值，繪制標準曲線。其線性回歸方程為：Y=0.002 1X+0.0483，R2=0.993，計算得到各樣品總酚含量。

圖1　櫻桃果汁及櫻桃酒中總酚酸含量Fig.1　The total phenolic acid content in cherry juice and cherry wine

如圖1所示，4種樣品總酚含量從高到低依次為：果汁>As2399>WineZ3>grapeZ2，櫻桃果汁中的總酚含量較3種櫻桃酒多。As2399櫻桃酒在與WineZ3櫻桃酒與櫻桃汁對比其酚酸的保留程度較大，相對于grapeZ2釀酒酵母較優。

2.1.2各酚酸化合物的測定分析

按1.3.2.2色譜條件對標準品與樣品進行分析，6種酚酸標準品色譜圖如圖2所示，grapeZ2櫻桃酒樣品色譜圖如圖3所示，各酚酸之間分離良好，選取色譜條件合適。樣品中各酚酸檢測結果如表2所示。 各酚酸類化合物添加回收率在93.50%～102.32%之間，滿足研究需要。櫻桃果汁與3種櫻桃酒中沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、香草酸、p-香豆素和阿魏酸均含量差異顯著(P<0.05)。檢測的6種酚酸類化合物中，除沒食子酸外，櫻桃酒中各酚酸含量較櫻桃汁果汁均有不同程度的增長。

1-沒食子酸；2-綠原酸；3-咖啡酸；4-香草酸；5-p-香豆素；6-阿魏酸圖2　酚酸類混合標準溶液色譜圖Fig.2　Chromatogram of mixed standards on pheolic acid

1-沒食子酸；2-綠原酸；3-咖啡酸；4-香草酸；5-p-香豆素；6-阿魏酸圖3　grapeZ2櫻桃酒酚酸色譜圖Fig.3　Phenolic acids chromatograms of grapeZ2 cherry wine

表2　櫻桃果汁及櫻桃酒中各酚酸含量

注：同行不同字母代表差異顯著(P<0.05，n=3)。

As2399櫻桃酒中p-香豆素的含量顯著高于另2種酵母所釀櫻桃酒(P<0.05),沒食子酸、咖啡酸、綠原酸、咖啡酸、香草酸及阿魏酸的含量在As2399和grapeZ2 2種櫻桃酒差異不顯著(P<0.05);WineZ3所釀櫻桃酒中各酚酸的含量均為最少。

2.2黃酮類化合物的檢測分析

2.2.1總黃酮含量測定

總黃酮含量的測定以槲皮素為參照，橫坐標為槲皮素濃度(g/L)，縱坐標為對應的吸光度值繪制標準曲線。線性回歸方程為：Y=0.011 95X+0.079 58，R2=0.992，計算得到各樣品中總黃酮的含量。

圖4　櫻桃果汁及櫻桃酒中總黃酮含量Fig.4　The total flavonoid content of cherry juice and cherry wine

如圖4所示，4種樣品總黃酮含量從高到低依次為：果汁>As2399>WineZ3>grapeZ2，櫻桃酒中總黃酮含量較櫻桃汁中減少，是因為在釀造的過程中的一些次級代謝產物會與黃酮發生反應，形成大分子衍生物[19]。雖然3種酵母釀造的櫻桃酒中總黃酮含量較其果汁中少，但利用As2399和WineZ3釀酒酵母所釀造的櫻桃酒總黃酮相對櫻桃果汁變化小，總黃酮在As2399與WineZ3所釀櫻桃酒中的保留較高，相對于grapeZ2酵母較優。

2.2.2各黃酮類化合物的分析測定

按1.3.3.2色譜條件對標準品與樣品進行測定，7種黃酮標準品色譜圖如圖5所示，As2399櫻桃酒樣品色譜圖如圖6所示，各黃酮之間分離良好，選取色譜條件合適。樣品中各黃酮檢測結果如表3所示。

如表3所示，添加回收率在92.66%～106.82%，可滿足研究需要。櫻桃汁與3種櫻桃酒中蘆丁、白藜蘆醇、槲皮素、山奈酚含量差異不顯著(P<0.05)，樣品中沒有檢出漢黃芩素，只在As2399櫻桃酒中檢測到黃芩素。結果表明櫻桃汁在酵母作用的發酵過程中，蘆丁、白藜蘆醇、槲皮素、山奈酚的結構與含量是穩定的。

1-蘆??；2-白藜蘆醇；3-槲皮素；4-山奈酚；5-黃芩素；6-漢黃芪素圖5　黃酮類混合標準溶液色譜圖Fig.5　Chromatogram of mixed standards on flavonoids

1-蘆?。?-白藜蘆醇；3-槲皮素；4-山奈酚；5-黃芩素圖6　As2399櫻桃酒黃酮色譜圖Fig.6　Flavonoids chromatograms of As2399 cherry wine

黃酮種類出峰時間/min回歸方程相關系數R2回收率/%檢出量/(mg·L-1)As2399grapeZ2WineZ3果汁蘆丁15.182Y=21.570X-2.78140.9994102.3817.063±0.61a16.813±0.32a16.363±0.18a19.173±6.5a白藜蘆醇22.070Y=83.064X-2.78140.999597.983.410±0.01a3.410±0.003a3.407±0.003a3.417±0.01a槲皮素25.747Y=23.6814X-3.1850.999396.8113.830±0.05a13.813±0.08a13.797±0.08a13.747±0.09a山奈酚28.668Y=28.5486X-3.8500.9993106.8213.543±0.04a13.300±0.05a13.417±0.23a13.387±0.70a黃芩素30.448Y=40.734X-5.5310.999497.8513.687±0.06ndndnd漢黃芩素34.647Y=18.3834X-5.4310.99492.66ndndndnd

注：同行不同字母代表差異顯著(P<0.05，n=3)。

2.3有機酸類化合物的分析

按1.3.4色譜條件對標準品與樣品進行測定，7種有機酸標準品色譜圖如圖7所示，櫻桃汁樣品色譜圖如圖8所示各有機酸之間分離良好，選取色譜條件合適。樣品中各有機酸檢測結果如表4所示。

由表4可知，各有機酸添加回收率在91.93%～105.85%，可滿足研究需要。櫻桃汁與3種櫻桃酒中草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸含量均差異顯著(P<0.05)。蘋果酸是櫻桃果汁和櫻桃酒中含量最高的。櫻桃果汁中的草酸在經過釀造后，含量降低，As2399釀酒酵母對草酸有很好的保留性與穩定性。3種櫻桃酒中蘋果酸、琥珀酸、富馬酸沒有顯著差異。As2399櫻桃酒中草酸、酒石酸與檸檬酸含量較另2種酵母發酵櫻桃酒高。As2399櫻桃酒中沒有檢測到乳酸。As2399釀酒酵母相對較優。蘋果酸作為天然果汁的重要成分，味道溫潤、香味特殊、余味時間長[20-21]；檸檬酸有清爽的酸味，口感溫和清爽，有新鮮感，后苦時間短[22]；琥珀酸的味感較濃，既苦又咸，引起唾液的分泌，最富有味覺特征，可使酒的滋味濃厚，增加醇厚感；乳酸微奶味、酸味微弱尖利，稍有澀味[23-24]。有機酸的含量差異在櫻桃酒的口感和風味上起重要作用，對有機酸含量的控制也對釀造工藝的優化提供了理論依據。

1-草酸；2-酒石酸；3-蘋果酸；4-乳酸；5-檸檬酸；6-琥珀酸；7-富馬酸圖7　有機酸混合標準溶液色譜圖Fig.7　Chromatogram of mixed standards on organic acids

1-草酸；2-蘋果酸；3-乳酸；4-檸檬酸；5-琥珀酸；6-富馬酸圖8　櫻桃汁有機酸色譜圖Fig.8　organic acids of cherry juice

表4　櫻桃果汁及櫻桃酒中各有機酸含量

注：同行不同字母代表差異顯著(P<0.05，n=3)。

3　結　論

本研究通過高效液相色譜法，在保證分離效果的同時，對3種不同釀酒酵母所釀的櫻桃酒及其果汁的活性物質進行比較，對最優釀酒酵母進行了篩選。實驗結果表明櫻桃酒在釀造的過程中，酚酸類化合物與黃酮類化合物的含量均會比櫻桃果汁中減少。4種樣品總酚含量依次為：果汁>As2399>WineZ3>grapeZ2；總黃酮含量依次為：果汁>As2399>WineZ3>grapeZ2。As2399櫻桃酒中的總酚酸及總黃酮量保留最高。SUN[25]等人也利用不同釀酒酵母對其多酚類物質進行篩選，其篩選的最優酵母所釀櫻桃酒中總酚含量為742.7mg/L與本實驗中總酚703.85mg/L差異不大。

櫻桃酒中的綠原酸、咖啡酸、香草酸、p-香豆素和阿魏酸的含量均顯著高于櫻桃果汁，As2399櫻桃酒中p-香豆素的含量顯著高于另2種酵母所釀櫻桃酒(P<0.05)，沒食子酸、咖啡酸、綠原酸、咖啡酸、香草酸及阿魏酸的含量在As2399和grapeZ2 2種櫻桃酒差異不顯著(P<0.05);WineZ3所釀櫻桃酒中各酚酸的含量均為最少。櫻桃酒與櫻桃果汁中的蘆丁、白藜蘆醇、槲皮素、山奈酚含量無明顯變化，在As2399櫻桃酒檢測到了黃芩素。3種櫻桃酒中酒石酸、蘋果酸、檸檬酸含量均比櫻桃果汁中增加；草酸含量均比櫻桃果汁減少，3種櫻桃酒中草酸、檸檬酸、富馬酸無顯著差異(P<0.05)，As2399櫻桃酒中酒石酸、檸檬酸與琥珀酸含量較另2種櫻桃酒高，蘋果酸是所測各機酸中含量最多的，As2399櫻桃酒中的蘋果酸較櫻桃汁增加了56.31%。高衛衛[16]利用反向高效液相色譜法對櫻桃酒中的有機酸類化合物進行了定量定性分析，其所測定的蘋果酸、乳酸、檸檬酸、草酸均遠小于本實驗所篩選出的As2399櫻桃酒。原因可能是所選用的櫻桃品種或釀酒酵母不同。通過對3種酵母中的酚酸類物質、黃酮類物質和有機酸類物質進行綜合考量，As2399釀酒酵母明顯優于另兩種酵母。關于櫻桃品種對櫻桃酒品質的影響，需要在后續研究中探究。

本實驗建立的櫻桃汁和櫻桃酒中的各酚酸類化合物、黃酮類化合物及有機酸類化合物的高效液相色譜檢測方法，各活性成分得到了良好的分離，操作簡便且具有良好的靈敏性和檢測度。釀酒酵母的篩選為櫻桃酒釀造工藝的研究提供了理論基礎。

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Analysisofactiveingredientincheeryjuiceanddifferentcherrywinebyhighperformanceliquidchromatography

LYUGuo-tao1,NIUYu2,SHANLu1,JIPei-shuang1,ZHANGLi-zhen1*

1(SchoolofLifeScience,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China)2(InstituteofAgriculturalResourcesandEconomy，ShanxiAcademyofAgriculturalSciences，Taiyuan030006,China)

ThecurrentstudywascarriedouttoelucidatetheeffectofinoculationofAs2399,grapeZ2,WineZ3yeastonthechemicalmaterialsproductionincherrywines,especiallythecontentsofphenolicacids,flavonoids,andorganicacids.Thequalitativeandquantitativedeterminationofphenolicacids,flavonoidsandorganicacidsincherrywineandcherryjuicewerecarriedoutbyHPLC.Resultsshowedthattherewasgoodlinearrelationshipamongthecontentofthephenolicacids,flavonoids,andorganicacids(R2>0.992).Therecoveryrateatdifferentadditionlevelswere91.93%-106.82%.AnalysisoffoursamplesshowedthatthebestyeaststrainwasAs2399.Thetotalcontentsofphenolicacidandflavonoidsincherrywinewerelowerthanthoseincherryjuice.Theorderoftotalcontentofphenolicacidinthefoursampleswasasfollows:fruitjuice>As2399>WineZ3>grapeZ2.Theorderoftotalcontentofflavonoidswasasfollows:fruitjuice>As2399>WineZ3>grapeZ2.Thecontentsofchlorogenicacid,coffeeacid,vanillaacid, p-coumarinandferulicacidincherrywineweresignificantlyhigherthanthoseincherryjuice.Thecontentofp-coumarininAs2399cherrywinewassignificantlyhigherthanthoseintheothertwokindsofcherrywine.Therewasnosignificantdifferencebetweencherrywineandcherryjuiceonthecontentofrutin,resveratrol,quercetinandkaempferol.HuangQinsuonlywasdetectedincherrywineAs2399.Thecontentsoftartaricacid,malicacidandcitricacidinthethreekindsofcherrywineweremorehigherthanthatincherryjuice,butthecontentofoxalicacidwaslowerthanthatincherryjuice.Therewasnosignificantdifferenceinthethreekindsofcherrywineonthecontentofoxalicacid,citricacidandfumaricacid.Thecontentoftartaricacid,citricacidandfumaricacidinAs2399cherrywinewerehigherthanthoseintheother2kindsofcherrywine.

cherrywine;activeingredient;highperformanceliquidchromatography(HPLC); Saccharomyces cerevisiae

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608030

碩士研究生(張麗珍教授為通訊作者，E-mail：lizhen@sxu.edu.cn)。

山西省科技廳重點研發計劃(農業)(2016)

2016-03-01,改回日期：2016-03-28