乳酸菌發酵茶飲料的工藝優化及其發酵前后香氣成分分析

劉佳奇，熊濤，李軍波，廖良坤，黃濤

(南昌大學 食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

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乳酸菌發酵茶飲料的工藝優化及其發酵前后香氣成分分析

劉佳奇，熊濤*，李軍波，廖良坤，黃濤

(南昌大學 食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

以鐵觀音浸提液為原料，經植物乳桿菌發酵，通過單因素和正交試驗確定乳酸菌發酵茶飲料的最佳工藝條件，并采用頂空固相微萃取(HeadspaceSolid-PhaseMicroextraction,HS-SPME)結合氣相色譜/質譜聯用(GasChromatography-MassSpectrometry,GC-MS)技術分析了乳酸菌發酵茶飲料發酵前后主要揮發性成分。最佳發酵工藝為：果葡糖漿添加量質量濃度為8%，植物乳酸菌發酵劑接種量質量分數為0.1%，發酵溫度37℃，發酵時間36h。發酵后的茶飲料較發酵前含有較多的醇類和酯類等揮發性風味成分，使鐵觀音發酵茶飲料兼有茶香和乳酸菌發酵香氣。經離心、調配后所得產品澄清透明、風味獨特、口感醇正。

乳酸菌；發酵工藝；茶飲料；風味物質

乳酸菌是一群能利用碳水化合物(主要指葡萄糖)發酵產生大量乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱[1]。大量研究表明，乳酸菌不僅可以提高食品的營養價值，改善食品風味，還可以提高食品的保藏性和附加值[2-3]。目前，乳酸菌的特殊生理活性和營養功能[4]，正日益引起人們的重視，乳酸菌飲料也因其營養保健功能和獨特風味深受消費者青睞。茶飲料具有方便、天然、營養保健等特點，被譽為“21世紀首選飲料”[5]。目前乳酸菌發酵茶飲料在市場上還未見到，相關研究也不多。陳萬庚[6]用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌以綠茶枸杞子為原料，通過浸提、乳酸發酵等工藝生產出了乳酸發酵枸杞綠茶飲料。江潔[7]以玉米淀粉糖漿對紅茶進行浸提，對茶浸提液進行乳酸菌和酵母菌的共生發酵，通過一系列實驗開發出了發酵紅茶飲料。閆剛，熊昌云[8]以云南CTC紅茶為原料，經乳酸菌、酵母菌共生發酵，研究了發酵型紅茶飲料的加工工藝。目前的研究大多集中在多菌種混合發酵，開發出的產品營養豐富，風味獨特，但生產成本高、工藝操作復雜且生產中容易受到雜菌污染，因此不利于工業化生產，而針對乳酸菌單菌種發酵的工藝探索國內外未見報道。積極開發乳酸菌發酵茶飲料，同時發揮茶和乳酸菌的功能，將成為飲料市場上的主力軍。

本文選用鐵觀音茶浸提液為基質，接種植物乳桿菌發酵劑進行發酵，研究其最佳發酵工藝條件，同時對口感風味進行初步探討，旨在開發一款營養豐富，口感醇正的乳酸菌發酵茶飲料，為后續的規模化生產提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與設備

1.1.1實驗材料

鐵觀音茶葉購買于江西省南昌市茶葉市場，植物乳桿菌菌劑(NCU177)保藏于江西省南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，果葡糖漿、白砂糖均為食品級。

1.1.2主要儀器和設備

YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設廠；DNP-9272型生化培養箱，上海精宏試驗設備有限公司；LXJ-IIB型低速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；FE20型pH計，Mettler-ToledoGroup；PB203-N型電子天平，Mettler-ToledoGroup；YP5001分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；PAL-1手持式糖度計，廣州市愛宕科學儀器有限公司；Agilent7890/7000A三重串聯四級桿氣質聯用儀，安捷倫科技有限公司；手動固相微萃取進樣器、50/30μmDVB/CAR/PDMS57328-U萃取頭，美國Supelco公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司。

1.2工藝流程

茶葉→二次浸提→過濾→茶汁→調配(果葡糖漿)→ 滅菌→ 冷卻→ 接種乳酸菌→發酵→ 離心→ 上清液→ 配比(白砂糖)→ 灌裝→ 殺菌→ 成品

1.3操作要點

(1)浸提：均采用二次浸提合并法[9]。在茶水比1∶100(g∶mL)，浸提溫度95 ℃，浸提10min的條件下浸提茶湯后過濾得到茶汁，過濾的茶渣重復浸提1次，將2次浸提的茶汁合并后備用；

(2)過濾：300目尼龍紗布濾去茶渣；

(3)發酵：調整好成分進行滅菌，冷卻后加入菌種恒溫發酵；

(4)離心：發酵液于4℃靜置5h后離心取上清液備用；

(5)配比：白砂糖調配糖酸比；

(6)灌裝殺菌：調配后飲料灌裝入已消毒滅菌的玻璃瓶中，密封后在100 ℃水溫下滅菌20min。

1.4最佳發酵工藝條件的確定

1.4.1單因素實驗

分析果葡糖漿添加量、菌劑接種量、發酵溫度和發酵時間對發酵茶飲料品質的影響，以感官評分為主并結合發酵后的pH和酸度評價發酵效果。

1.4.2正交試驗

在單因素實驗的基礎上，以果葡糖漿添加量、接種量、發酵溫度和發酵時間為因素進行4因素3水平試驗，以感官評分為主并結合發酵后的pH和酸度確定最佳發酵工藝條件，正交試驗因素表見表1。

表1　正交試驗因素表

1.5分析方法

pH值測定：FE20型pH計；酸度測定：標準堿滴定法(以乳酸計)；可溶性固形物：PAL-1手持式糖度計；茶多酚：酒石酸鐵比色法，參照國標GB/T21733—2008。

1.6感官評定

組成10人的感官評定小組對飲料的色澤、風味和口感進行感官評分，總分100分，試驗重復3次，取平均值進行計算，評分標準見表2。

表2　產品感官評價標準

1.7風味成分測定方法

取樣液約6mL，置于20mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2cm～50/30μmDVB/CAR/PDMSStableFlex纖維頭的手動進樣器，在60 ℃頂空萃取30min后，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口中，熱解析5min。

色譜條件：色譜柱：HP-5；升溫程序：50 ℃保持5min，以3 ℃/min升至170 ℃，保持3min，以6 ℃/min升至210 ℃，再以15 ℃/min升至230 ℃，保持1min；載氣(He)流速1mL/min，進樣口溫度：250 ℃，進樣方式：不分流，溶劑延遲時間為1min。質譜條件：電子轟擊離子源，電子能量70eV；離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃；質量范圍m/z 20～450amu。

1.8數據處理

每個實驗均重復3次，數據采用Origin9.0作圖。GC-MS定性分析通過AgilentMassHunter來完成實驗數據的采集和分析，并通過CAS號及配比度確定風味物質的種類；定量分析采用AgilentMassHunter色譜工作站軟件，根據色譜圖保留峰面積計算出各種香氣成分的相對含量。

2　結果與分析

2.1乳酸菌發酵茶飲料的單因素實驗

2.1.1果葡糖漿添加量對發酵茶品質的影響

果葡糖漿作為乳酸菌發酵的碳源，其添加量會直接影響乳酸菌的生長情況。添加量過少，乳酸菌生長遲緩，使產品香味不足；添加量過多，滲透壓過高阻礙乳酸菌的生長，還會使口感過于甜膩[10]。由圖1可知，隨著果葡糖漿濃度的增大，pH值緩慢下降之后趨于穩定，酸度反之，感官評分也隨著果葡糖漿的增加而提高，當添加量質量濃度為6%時，產品發酵后的平均感官評分最高，之后隨著果葡糖漿添加量持續增加，口感偏甜，接受性變差，因此，選擇果葡糖漿最佳添加量為6%。

圖1　果葡糖漿添加量對酸度、pH和感官評分的影響Fig.1　Effect of syrup content on acidity,pH and sensory score

2.1.2乳酸菌接種量對發酵茶品質的影響

乳酸菌接種量大小直接影響發酵產品的品質，接種量過低，發酵時間較長，產酸量低且容易受到雜菌污染；接種量過高，發酵速度雖能加快但微生物細胞易衰老，出現自溶現象，影響產品風味[11]。

圖2　接種量對酸度、pH和感官評分的影響Fig.2　Effect of inoculation on acidity, pH and sensory score

由圖2可知，隨著接種量的增加，pH值呈現下降的趨勢，產品的酸度呈現上升趨勢。這是因為接種量的增加使起始發酵液中乳酸菌數增加，產酸能力增強，發酵茶飲料的酸度上升較快，pH下降也較快。從感官評分可以看出，接種量太少會導致口感偏淡，發酵風味不明顯，接種量過多產酸較多，飲品酸度較高，難以接受，當接種量質量濃度為0.1%時，平均感官評分最高。考慮到工業化生產成本及能耗，最終選擇質量濃度0.1%接種量為最佳條件。

2.1.3發酵溫度對發酵茶品質的影響

發酵溫度的不同對發酵茶中的乳酸菌生長情況及發酵產品的風味有較大影響。從圖3可知，pH值隨溫度的升高先下降后上升，酸度反之，發酵溫度為37 ℃時感官評分最高。植物乳桿菌最適生長溫度為37 ℃，在此環境條件下，該菌的生長和代謝旺盛，發酵性能強，發酵后產品口感極佳。因此，選擇37 ℃為最佳發酵溫度。

圖3　發酵溫度對酸度、pH和感官評分的影響Fig.3　Effect of fermentation temperature on acidity, pH and sensory score

2.1.4發酵時間對發酵茶品質的影響

發酵時間的長短會直接影響發酵茶產品的口感和風味。由圖4可以看出pH值隨著發酵時間延長呈現前期迅速下降后期緩慢降低的趨勢，酸度反之，發酵36h平均感官評分最高。發酵時間過短，飲品發酵味不足，發酵時間過長，茶飲品悶熟味明顯，接受性差。綜合感官評分和酸度、pH值及考慮到生產能耗，選擇36h為最佳發酵時間。

圖4　發酵時間對酸度、pH和感官評分的影響Fig.4　Effect of fermentation time on acidity, pH and sensory score

2.2正交試驗結果及分析

在單因素實驗的基礎上，以果葡糖漿添加量、接種量、發酵時間、發酵溫度進行4因素3水平的實驗分析，通過感官評分和發酵酸度、pH綜合考慮，確定乳酸菌發酵茶飲料的最佳工藝條件，試驗結果見表3。

表3　正交試驗結果

通過表3的數據和極差分析可知，果葡糖漿添加量(A)、接種量(B)、發酵溫度(C)和發酵時間(D)這4個因素對產品感官評分影響的順序為A>D>C>B。正交實驗理論上最佳組合為A3B1C2D2，但在9個試驗號中都沒有出現，正交表中 A2B3C1D2的感官評定分數最高，其次是A3B1C3D2。因此，選擇A3B1C2D2、A2B3C1D2和A3B1C3D2組合重復3次試驗進行驗證，結果見表4。組合A3B1C2D2的平均感官評分最高，證明正交試驗是可信的，結合pH和酸度，考慮到生產成本和能耗，最終選擇A3B1C2D2為最優組合，即果葡糖漿添加質量濃度8%、接種量質量濃度0.1%、發酵溫度37 ℃、發酵時間36h。

表4　驗證試驗結果

2.3發酵茶飲料的風味調配

鐵觀音浸提液發酵后的pH值在3.3左右，口感較酸，需添加糖調節糖酸比。將發酵茶浸提液經4 ℃冷藏5h后，離心得上清液備用。考慮到飲品已含有較多的乳酸，在此不考慮另外加酸，直接用白砂糖進行調配，經感官評定確定調配濃度。從圖5感官評定的雷達圖可以看出，當白砂糖添加量為2%時產品最受歡迎。

圖5　不同白砂糖添加量的感官評定雷達圖Fig.5　Radar chart of different amount of sugar

2.4乳酸菌發酵茶飲料揮發性香氣成分

揮發性成分是發酵飲料品質的一個重要因素采用HS-SPME/GC-MS法測定乳酸菌發酵鐵觀音茶飲料發酵前后的揮發性風味成分，結果見表5所示。

鐵觀音茶浸提液在發酵前后的風味物質變化明顯，發酵前檢測出香氣成分20種，其中醛類4種，醇類、酮類各3種，萜烯類、酸類、烷烴類和含氮化合物各2種，脂類和酚類各1種。醇類、萜烯類和含氮化合物為主要香氣成分，分別占香氣揮發物總量的12.73%、43.92%和26.97%。香氣物質含量較高的有羅勒烯、吲哚和芳樟醇，這些都是鐵觀音的特征香氣成分[12-13]，發酵前茶香明顯；發酵后檢測出香氣成分30種，其中醇類8種，酮類6種，酯類5種，萜烯類和醛類各3種，酸類和含氮化合物各2種，烷烴類1種。醇類、萜烯類和含氮化合物相對含量依然較高，分別為27.3%、30.46%和13.08%，其中除了羅勒烯、吲哚、芳樟醇、2,4,6-三叔丁基苯酚和苯乙腈的相對含量相比于發酵前稍有下降，其他香氣成分含量均有上升。此外，新出現的10種物質以醇類和酯類居多，其中香葉基丙酮本身就是茶葉中的香氣物質[14-15]，但發酵前卻未曾檢出，說明通過發酵會增加主體茶香。其他新風味物質中，2-壬醇和丁位十一內酯具有奶油香，肉硅酸戊酯、香葉基丙酮和異戊酸香葉酯具有果香，而二氫茉莉酮和植物醇具有花香。這些物質的形成對發酵茶飲料的風味起到了積極的作用。

表5　發酵茶飲料揮發性風味成分

注：-表示未檢出或是匹配度<80

綜上所述，茶飲料發酵前主要揮發性成分是醇類、萜烯類和含氮化合物，發酵結束后不僅能保持原茶本身特有的香氣，還產生了其他醇類和酯類等揮發性成分。研究報道[16]，醇類物質是微生物在氨基酸代謝中產生的，酯類物質具有水果香，可以在乳酸菌的作用下由醇類和有機酸生成。這些新的風味物質成為了發酵茶飲料獨特香氣的關鍵。

2.5乳酸菌發酵茶飲料產品質量標準

2.5.1感官指標

色澤：淡黃色；氣味：兼有乳酸菌發酵香味及鐵觀音特有的茶香，無異味；滋味：口感醇厚，酸甜適中；組織狀態：清澈透明，久置后允許有少量沉淀，無分層現象。

2.5.2理化指標

pH值：3.3±0.1，酸度(以乳酸計)：(0.70±0.1)g/L，可溶性固形物≥8.0%，茶多酚≥700mg/kg。

2.5.3微生物指標

細菌總數≤40CFU/mL，大腸菌群≤1CFU/mL，致病菌未檢出。

3　結論

本文以pH、酸度和感官評定為指標，通過單因素和正交試驗確定了發酵型鐵觀音茶飲料的最佳發酵工藝參數為：果葡糖漿添加量質量濃度為8%，植物乳桿菌發酵劑接種量為0.1%，發酵溫度37 ℃，發酵時間36h；發酵后的飲料經過冷卻離心后取上清液，以2%的白砂糖進行調配口感最佳；GC-MS分析表明，醇類、萜烯類和含氮化合物為茶飲料的主要呈香物質，發酵前后檢測出香氣成分分別為20種和30種，發酵后新物質以醇類和酯類居多，這些物質協同作用，使茶香與發酵香渾然一體，賦予了發酵茶飲料獨特的風味。本方法研制的乳酸菌發酵茶飲料，采用單一植物乳桿菌作為發酵劑，打破了傳統的混菌種發酵理念，很好的將乳酸菌與茶浸提液合二為一，開發出了工藝操作簡單、成本低、品質優和高附加值的飲品，豐富了發酵食品的種類，也為茶飲料的研發提供了新的途徑。

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Processoffermentedteabeveragewithlacticacidbacteriaandanalysisofitsaromacomponentsbeforeandafterfermentation

LIUJia-qi,XIONGTao*,LIJun-bo,LIAOLiang-kun,HUANGTao

(StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,SchoolofFoodScienceandTechnology，NanchangUniversity,Nanchang330047,China)

TieguanyinteainfusionwasusedasmainrawmaterialtoproducefermentationteabeveragewithLactobacillus plantarum.Thefermentationconditionswereoptimizedbysinglefactorandorthogonalexperiment.Theheadspacesolid-phasemicroextraction-gaschromatography-massspectrometry(HS-SPME-GC-MS)wasusedtodeterminethearomacompoundsbeforeandafterfermentation.Theoptimumconditionsshowedthattheconcentrationofsyrupwas8%,inoculationamountwas0.1%,fermentationtemperaturewas37 ℃,fermentationtimewas36h.Theresultsofgaschromatography-massspectrometryshowedthatafterfermentation,teabeverageproducedmorevolatileflavorcomponentssuchasalcoholsandesters,whichresultedinteaaromaandlacticacidfermentationaromaofthebeverageatthesametime.Thisproductwasclearandtransparentandpossessedmellowtasteanduniqueflavorafterfiltrationandpreparation.

lacticacidbacteria;fermentationtechnology;teabeverage;flavoringcompositions

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608020

碩士研究生(熊濤教授為通訊作者，E-mail：xiongtao0907@163.com)。

“贛鄱英才555工程”領軍人才培養計劃(贛才字[2013]2號)；國家農業科技成果轉化項目“益生菌高效發酵果蔬飲料綠色技術研究” (贛財農指[2014]120號)；江西省現代農業產業技術體系建設專項(JXARS-06)

2015-12-29,改回日期：2016-03-21