“一鍋法”生物轉化富馬酸制備L-天冬酰胺

張奇，姜增妍，張露，馬玉岳，徐友強，裴疆森，程池*

1(中國食品發酵工業研究院，中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)　2(山東省富馬酸生物轉化工程技術研究中心，山東 煙臺，265709)

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“一鍋法”生物轉化富馬酸制備L-天冬酰胺

張奇1，姜增妍2，張露1，馬玉岳2，徐友強1，裴疆森1，程池1*

1(中國食品發酵工業研究院，中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)2(山東省富馬酸生物轉化工程技術研究中心，山東 煙臺，265709)

L-天冬酰胺廣泛應用于食品、醫藥、化工合成和微生物培養等領域。目前工業上主要依靠化學合成和直接提取方法制備。該研究首次采用雙酶催化富馬酸“一鍋法”制備L-天冬酰胺。克隆來源于大腸埃希氏菌JM109的天冬酰胺合成酶A基因asnA，并于產L-天冬氨酸酶的E.coliCICC 11022S中表達，表達的蛋白分子質量約為37 kDa，與預期大小相符，比酶活力為1443.7 U/g。利用構建的工程菌E.coliCICC 11022S/pET28a(+)-asnA全細胞高密度催化富馬酸生產L-天冬酰胺，以高效液相色譜法及PITC柱前衍生-高效液相法檢測底物、中間產物和終產物，轉化10 h，富馬酸轉化率為94.7%，L-天冬酰胺產量可達125.1g/L，生產速率為12.51 g/(L·h)。

一鍋法；富馬酸；天冬酰胺合成酶；L-天冬酰胺；生物轉化

L-天冬酰胺(L-asparagine，L-Asn)，又名天門冬酰胺、天門冬素、α-氨基丁二酸一酰胺，于1806年首次被法國化學家LOUIS和PIERRE從蘆筍汁中分離，隨后陸續在各種動植物體內發現并分離，廣泛應用于食品、醫藥、化工合成和微生物培養等領域[1]。

L-天冬酰胺與糖能進行氨基-羰基反應，形成特殊的香味物質，可作為食品添加劑用于清涼飲料；同時，它也是微生物培養和動物細胞培養重要的添加劑[2]。L-天冬酰胺常用于氨基酸輸液及降壓、平喘、抗消化性潰瘍和胃功能障礙等，并可用于治療心肌梗死、心肌代謝障礙、心力衰竭、心臟傳導阻滯和疲勞癥等。它對于大腦的發育和其功能是必需的。此外，它能通過解除高谷氨酰胺抑制引發的細胞凋亡，進而實現腫瘤的治療[3]。在寡糖轉移酶的作用下，L-天冬酰胺能夠與N-乙酰氨基葡糖在內質網內結合，對于蛋白質結構的穩定與功能的發揮至關重要，是蛋白質糖基化的重要形式[4-6]。

目前，L-天冬酰胺的制備主要采用提取法和化學合成法。提取法是通過從富含L-天冬酰胺的天然材料如白羽扇豆、草木樨等中分離[7]。該方法受原材料質量因素影響大，工藝復雜不易控制，且污染嚴重。化學合成法主要通過L-天冬氨酸與氨水進行酰胺化制得[8]。該方法存在污染大、副反應多等缺陷。

通過天冬酰胺合成酶催化銨離子或谷氨酰胺的氨基進行轉移的生物合成過程為耗能過程，需要大量ATP參與(圖1)[9-11]，由此使生產成本大幅提升，限制了應用，因此國內外鮮有報道，但該過程反應條件溫和、生產效率高、副產物少，同時對設備的要求低、投資小、生產過程簡單，易于操控，仍具有一定的開發前景。本課題組前期構建了1株高產天冬酰胺合成酶的菌株大腸埃希氏菌CICC 11034S (EscherichiacoliCICC 11034S)，采用活細胞自身糖酵解系統成功實現L-天冬氨酸轉化生產L-天冬酰胺，有效解決了ATP成本過高的難題[12]。

圖1　L-天冬酰胺生物合成Fig.1　Biosynthesis of L-asparagine

“一鍋法”源于化學合成，指兩步或兩步以上的化學反應在一個反應體系中一次合成目的產物，具備操作簡單、省時省力、成本低廉等優點。隨著酶工程技術和分子生物學技術的發展，在一些特定目的產物的酶法合成中也引入了相應的方法，即在一個反應體系內加入多種酶，同步催化反應以獲得目的產物[13]。

本研究在前期研究的基礎上利用分子生物學手段，將大腸埃希氏菌JM109的天冬酰胺合成酶A基因(Asparagine Synthetase A gene,asnA)擴增并轉化至高產天冬氨酸酶的E.coliCICC 11022S中，構建工程菌E.coliCICC 11033S，誘導表達后，利用菌體自身糖酵解功能合成的ATP，進行全細胞催化，實現從富馬酸向L-天冬酰胺的雙酶催化“一鍋法”生物合成，有效節省生產時間，并解決了L-天冬酰胺生產過程中消耗ATP的高成本問題。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

E.coliJM109、E.coliCICC11022S、pET28a(+)為實驗室保藏；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside, IPTG)、硫酸卡那霉素(Kanamycin Monosulfate,Kan)、DNA Marker、蛋白質Marker、分子生物學試劑盒購于天根(北京)；異硫氰酸苯酯(Phenyl isothiocyanate, PITC)、ATP購于生工(上海)；培養基購于陸橋(北京)；其他化學試劑均為國產分析純或色譜純。

1.2asnA基因克隆及工程菌構建

采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取E.coliJM109基因組DNA，以此為模板，以AsnAU(5’-GCC GAA TTC ATG AAA ACC GCT TAC-3’，攜帶EcoRI酶切位點)和AsnAD(5’-GTT AAG CTT TTA CAG CAG AGA AGG GAC-3’，攜帶HindIII酶切位點)為引物PCR擴增asnA，經EcoRI和HindIII酶切后連接至相同酶切后的pET28a(+)，轉化至具備表達天冬氨酸酶能力的E.coliCICC11022S，隨后篩選轉化子進行PCR及酶切鑒定，選取陽性克隆測序分析。

1.3ASNA表達及分析

將構建的基因工程菌于LB/Kan(含50 μg/mLKan的LB培養基)中37 ℃，200 r/min，過夜培養后，1%轉接LB/Kan培養液3 h后加入終濃度0.1 mmol/L IPTG 25 ℃，160 r/min，誘導6 h，收集菌體，超聲破碎后離心收集上清液進行SDS-PAGE分析。

酶活力定義：在200 mmol/LL-天冬氨酸、10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L NH4Cl、10 mmol/L ATP、100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)、菌體濕重20 mg/mL體系下，37 ℃催化反應30 min，以1 min催化L-天冬氨酸產生1 μmolL-天冬酰胺所需的酶量定義為1個酶活單位(U)。

1.4高效液相分析

底物富馬酸采用高效液相色譜(HPLC)檢測，色譜條件為：色譜柱，GRACE Prevail Organic Acid(25 mm× 4.6 mm)；流動相，A∶B=95∶5(A：10 mmol/L KH2PO4(pH2.3)；B：甲醇)；檢測器，VWD-3000RS；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；流速：0.6 mL/min；進樣量：10 μL；進樣質量濃度：5、10、20、50、100 mg/L。中間產物L-天冬氨酸及終產物L-天冬酰胺采用PITC柱前衍生-高效液相方法檢測[12]。

A：富馬酸色譜圖；B：富馬酸定量標準曲線圖2　底物富馬酸HPLC分析Fig.2　Analysis of fumaric acid by HPLC

富馬酸標準品(100 mg/L)的色譜圖如圖2A所示，根據不同濃度富馬酸的峰面積繪制標準曲線(圖2B)，回歸曲線方程為：Y=0.399 2X+0.009 7。以全細胞為酶原催化富馬酸轉化生產L-天冬酰胺，每1 h取樣1次，以HPLC法測定富馬酸，根據標準曲線計算富馬酸含量。

1.5全細胞催化

配制全細胞催化反應體系，將1 mol富馬酸加入800 mL水中，隨后以氨水調pH至8.0，使其充分溶解，隨后加入終濃度為20 mmol/L葡萄糖和2 mmol/L氯化鎂；離心發酵液，收集菌體，無菌水清洗后，將菌體加入轉化體系中，使菌體終濃度OD600 nm=12；最后將反應液體積定容至1 L，此時富馬酸濃度為1 mol/L。37 ℃、50 r/min催化反應14 h，每1 h取樣，以色譜法檢測底物富馬酸、中間產物L-天冬氨酸和終產物L-天冬酰胺。

2　結果與分析

2.1工程菌株構建

以E.coliJM109基因組DNA為模板進行PCR擴增，隨后通過限制性內切酶酶切、回收并連接，轉化至宿主菌E.coliCICC11022S中，篩選轉化子進行PCR和酶切鑒定，結果如圖3所示，經PCR擴增，可于1 000 bp處觀察到明顯的條帶；篩選轉化子，進行PCR和酶切鑒定，于1 000 bp處可見明顯的目的基因PCR擴增條帶和酶切條帶，表明已成功構建含目的基因asnA的基因工程菌株，命名為E.coliCICC11022S/pET28a(+)-asnA，并于中國工業微生物菌種保藏中心保藏，保藏號：CICC 11033S。

M-DNA Marker；1-PCR產物；2-PCR鑒定；3-酶切鑒定圖3　asnA基因克隆及轉化子鑒定Fig.3　Amplification and identification of asnA gene

2.2天冬酰胺合成酶A表達及酶活力分析

將誘導表達的工程菌裂解液進行SDS-PAGE分析，結果如圖4所示，與含pET28a(+)空載體的對照菌株E.coliCICC 11022S/pET28a(+)相比，E.coliCICC11022S/pET28a(+)-asnA裂解上清液與沉淀中均在約37 kDa處可見蛋白表達條帶，與預期大小36.6 kDa相符，其表達后存在形式包括可溶性蛋白和包涵體兩種。

以菌體細胞為酶原按酶活力定義所述方法測定表達的天冬酰胺合成酶A的酶活力，其比酶活力為1 443.7 U/g。

M-Marker；1-E. coli CICC11022S/pET28a(+)-asnA裂解上清液； 2-E. coli CICC11022S/pET28a(+)裂解上清液；3-E. coli CICC11022S/pET28a(+)-asnA裂解沉淀圖4　SDS-PAGE分析Fig.4　SDS-PAGE analysis of ASNA expression

2.3轉化過程監測

以PITC-HPLC法測定L-天冬氨酸和L-天冬酰胺，根據[12]報道的標準曲線計算反應體系中L-天冬氨酸和L-天冬酰胺濃度，繪制過程曲線，結果如圖5所示，隨著反應時間的延長，富馬酸濃度逐漸降低；于此同時，L-天冬氨酸含量逐步提升，在4 h時，反應體系中L-天冬氨酸含量達最高，積累濃度達70 g/L以上，隨后逐漸下降；反應體系中L-天冬酰胺的含量隨著時間的延長持續上升，10 h時，L-天冬酰胺含量達高點，產量為125.1 g/L，綜合生產速率為12.51 g/(L·h) ，此時富馬酸的摩爾轉化率達94.7%。

圖5　轉化過程中底物與產物含量分析Fig.5　Analysis of substrate and product

3　討　論

天冬酰胺合成酶的結構包含催化活性區域和結合區域，即具有兩個反平行β-折疊的負責水解谷氨酰胺的活性部位的N-末端和負責結合Mg2+、ATP和L-天冬氨酸的C-末端兩部分。天冬酰胺合成酶可分為天冬酰胺合成酶A和天冬酰胺合成酶B，前者只可以利用銨離子進行L-天冬氨酸的酰胺化，后者的氨基既可來源于谷氨酰胺，也可以來源于銨離子。天冬酰胺合成酶A主要存在于微生物中，目前科研人員已經克隆并表達了多種微生物來源的天冬酰胺合成酶A基因[11]。本研究以E.coliJM109的基因組DNA為模板，成功克隆了asnA基因，與已知序列同源性為99.9%，僅一個堿基差異；蛋白序列同源性為100%。本研究構建的ASNA表達體系，能夠成功表達可溶性蛋白，由于目的蛋白大部分為可溶解狀態，盡管有部分蛋白質以包涵體存在于菌體裂解沉淀中，但不影響整個催化體系。

盡管天冬酰胺合成酶能催化L-天冬氨酸合成L-天冬酰胺，但由于其轉化過程中需要ATP的參與，導致成本過高，因此采用該酶進行生物轉化法生產L-天冬酰胺鮮有報道，而L-天冬酰胺生產技術也一直停留在化學合成法和直接提取法[1, 7-8]。本課題組前期報道了采用活細胞催化方式為從L-天冬氨酸到L-天冬酰胺轉化提供所需ATP的關鍵技術[12]。本研究對前期工作進一步延伸，采用單菌雙酶 “一鍋法”催化，從底物富馬酸直接轉化生產L-天冬酰胺，在簡化工藝、節省時間、節約人力成本的基礎上進一步降低了底物成本。

本研究建立了一套“一鍋法”生產L-天冬酰胺的生物轉化工藝，通過克隆天冬酰胺合成酶A基因并構建高效表達該酶的基因工程菌株，實現從富馬酸到L-天冬酰胺的生物酶法催化合成。以全細胞為酶原催化該反應，以葡萄糖替代ATP，通過菌體細胞自身的葡萄糖酵解體系和三羧酸循環，實現ATP的合成與再生，進而成功解決了L-天冬酰胺生物轉化生產工藝中ATP成本過高的難題。

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L-asparagine production by one-pot biotransformation method

ZHANG Qi1, JIANG Zeng-yan2, ZHANG Lu1, MA Yu-yue2,XU You-qiang1, PEI Jiang-sen1, CHENG Chi1*

1(China National Research Institute of Food & Fermentation Industries, China Center of Industrial Culture Collection, Beijing 100015, China)2(Shandong Biotransformation Engineering Research Center of Fumaric Acid, Yantai 265709, China)

L-asparagine was one of natural amino acids, which was widely used in food, medicine, chemical synthesis, microbial culture and so on, and mainly obtained by chemical synthesis or direct extraction methods. In this study, one-pot reaction was reported to synthesize L-asparagine by two kinds of enzyme. Asparagine synthetase gene A (asnA) fromEscherichiacoli(E.coli) JM109 was amplified and transformed intoE.coliCICC 11022S using molecular biological methods, and then the ASNA was expressed. The molecular weight of expressed protein was of about 37 kDa by SDS-PAGE, which was consistent with the expected size. After analyzing the ASNA activity, the enzyme activity was 1 443.7 U/g wet cell. Finally, the constructed strainsE.coliCICC 11022S/pET28a (+)-asnAwas applied on conversion from fumaric acid toL-asparagine. After catalyzing for 10 h, the substrate and product were detected by PITC column derivatization-high performance liquid. The conversion ratio of fumaric acid was 94.7%, the yield of L-asparagine was up to 125.1 g/L, and the production rate was 12.51 g/(L·h).

one-pot reaction； fumaric acid； Asparagine synthetase A；L-asparagine； biotransformation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608010

博士，副教授(程池教授級高級工程師為通訊作者，E-mail：cheng100027@163.com)。

2016-01-08，改回日期：2016-01-28