東北黑蜂椴樹蜜中耐高糖酵母菌分離鑒定及透射電子顯微鏡觀察

徐偉，杜嬌，杜鵑，徐春華，孟慶生，付大偉，王薇

1(哈爾濱商業大學 食品工程學院，黑龍江 哈爾濱,150076)2(大興安嶺綠源蜂業有限公司，黑龍江 加格達奇,165000)

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東北黑蜂椴樹蜜中耐高糖酵母菌分離鑒定及透射電子顯微鏡觀察

徐偉1*，杜嬌1，杜鵑1，徐春華2，孟慶生2，付大偉1，王薇1

1(哈爾濱商業大學 食品工程學院，黑龍江 哈爾濱,150076)2(大興安嶺綠源蜂業有限公司，黑龍江 加格達奇,165000)

從東北特產椴樹蜜中分離1株酵母菌，將初篩得到的酵母菌經過向發酵液中加入不同克數的葡萄糖發酵試驗性能測定的比較，篩選出1株適合用于蜂蜜釀造的具有耐受80 g/100 mL葡萄糖的高糖特性的酵母菌YMI-37，采用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察酵母菌YMI-37在不同葡萄糖濃度下細胞內部結構變化，并對YMI-37進行生理生化特性和分子生物學的鑒定，根據生理生化和26S rDNA基因測序綜合分析，初步鑒定為酵母菌屬的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

酵母菌；耐高糖；椴樹蜜；篩選；鑒定

椴樹蜜是一種營養豐富的高熱量食品，其主要成分是葡萄糖和果糖，占蜂蜜總糖的85%以上[1]，可以不經過消化作用而直接被人體吸收利用，蜂蜜具有潤肺止咳、潤腸通便、滋補強身、排毒養顏等功效[2-4]，是一種天然的滋補品，但由于含糖量高而使飲用人群受限。發酵飲料在國內外非常盛行，具有豐富的營養素，醇厚的香味成分，深得人們喜愛。酵母菌是釀造蜂蜜發酵飲料中主要的微生物，由于蜂蜜原料糖度高，在發酵時會引起酵母菌細胞水分活度和細胞質組成發生顯著變化，酵母菌的細胞膜及酶系受到破壞，從而抑制酵母菌的生長和發酵[5]，研究酵母菌耐高(糖、鹽)滲透壓下的遺傳特性以及高滲透壓下酵母菌的調節機理，具有非常重要的理論意義和應用價值。

高濃度發酵后稀釋釀造技術，是目前發酵工業領域一項先進的技術。篩選出耐高糖的酵母菌，應用于蜂蜜發酵飲品生產中，采用高濃度發酵再稀釋的方法，可節省能源，降低生產成本。本研究通過從東北黑蜂椴樹蜜中分離出6株耐高糖酵母菌株，進行復篩得到1株適合用于蜂蜜釀造的耐高糖特性酵母菌YMI-37，采用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察耐高糖酵母菌YMI-37在不同葡萄糖濃度下細胞內部結構變化，根據形態學觀察、生理生化及26S rDNA基因測序進行了系統的分析鑒定。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

蜂蜜為采集于東北的椴樹蜜。

酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂等均為生物試劑，葡萄糖、醋酸鈉、硝酸銨、硝酸鉀、亞硝酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等均為分析純。

1.2儀器及設備

HWS24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；LRH-70F生化培養箱，上海一恒科技有限公司；LDZX-50XB立式壓力蒸汽滅菌器，上海中安醫療器械廠；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；YS2-H顯微鏡，NiKon China；BS224S電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；H-113ATC手持糖度計 ，北京測維光電儀器廠；SBA-40D生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；S-3400掃描電子顯微鏡，HITACHI公司；ES-2030型冷凍干燥，HITACHI公司；E-1010型離子濺射鍍膜儀，HITACHI公司；JEM-2100F透射電鏡，HITACHI公司。

1.3方法

1.3.1分離鑒定培養基和培養方法

酵母培養基[6]；麥氏培養基；玉米粉培養基；糖類發酵培養基；碳源利用培養基；硝酸鹽利用培養基；類淀粉化合物形成測定培養基；尿素分解培養基。

富集培養：將蜂蜜進行稀釋，放入28 ℃恒溫培養箱內培養。

1.3.2酵母菌初篩

將富集培養后的樣品進行梯度稀釋，吸取1 mL富集培養液加入9 mL無菌生理鹽水中，稀釋成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6濃度，分別吸取上述稀釋梯度為10-4到10-6的菌液各0.1 mL涂布到已凝固的分離培養基上，用玻璃涂布器涂勻。每個稀釋度重復3次，放入到28 ℃恒溫培養箱內培養。

在酵母菌培養基平板上挑取菌落特征與酵母菌相似的單個孤立菌落，進一步在酵母菌平板上劃線分離，分離后挑取單個孤立的菌落制成水浸片后，觀察其細胞形態、大小進行酵母菌的初篩，觀察到細胞形態、大小基本一致，則為純菌。

1.3.3酵母菌復篩

挑取篩選出的純菌種以5%的量分別接入到含25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 g/100 mL葡萄糖的酵母菌液體培養基里[7-9]，放入28 ℃恒溫培養箱內培養，通過看試管中杜氏小管里的產氣情況和生物傳感儀測定的殘糖量，判斷發酵效果，挑選出耐糖量較高的菌種。

1.3.4菌種的生理生化鑒定

酵母菌特征觀察：觀察菌落形態，觀察細胞形態及測定大小、觀察子囊孢子的形成、觀察假菌絲的形成、觀察擲孢子形成[10-11]。

生理生化的檢測：糖類發酵試驗、同化碳源試驗、同化氮源試驗[12-14]、產生淀粉化合物試驗、尿酶試驗、產酸試驗[15-16]。

1.3.5菌種的分子生物學鑒定

篩選的耐高糖菌株，由生工生物工程(上海)有限公司進行 26S rDNA 鑒定[ 17-20]。

1.3.6菌種的TEM觀察

篩選的耐高糖菌株，采用TEM觀察不同葡萄糖濃度細胞內部結構變化。

2　結果與分析

2.1酵母菌的初篩

從蜂蜜中分離出6株耐高糖酵母菌株，發現菌落形態較單一，大小基本一致，初步確認為單一純種，編號為YMI-1、YMI-2、YMI-15、YMI-18、YMI-25、YMI-37，將其接種到復篩培養基上進行復篩。

2.2酵母菌的復篩

將培養好的種子液以5%的接種量接入帶有杜氏小管的試管中，28 ℃培養96 h，耐糖杜氏小管產氣結果見表1，生物傳感儀測定的發酵后的殘糖量結果見表2。

表1　六株酵母菌耐葡萄糖杜氏小管產氣結果

注：根據杜氏小管中產氣量分為5個等級;“++++”表示杜氏小管中充滿氣體;“+++”表示杜氏小管中充滿3/4氣體;“++”表示杜氏小管中充滿1/2氣體;“+”表示杜氏小管中充滿1/4氣體;“-”表示杜氏小管中沒有氣體。

杜氏小管耐高糖發酵過程中，酵母菌利用葡萄糖并將其轉化為乙醇和CO2，酵母菌在適宜的葡萄糖濃度下，能充分利用葡萄糖，其生長繁殖旺盛，但在葡萄糖濃度較高的環境下，由于滲透壓的作用使其細胞質、細胞膜、細胞內水分活度發生變化，酵母菌利用葡萄糖的能力下降，生長受到抑制，但有些酵母菌高糖環境下會在細胞內積累特定溶質來抵御其胞內水分子外流，使自身達到生長繁殖、發酵。所以通過杜氏小管產氣篩選耐糖性能較好的酵母菌。

表1結果為發酵96 h的結果，葡萄糖質量濃度在70 g/100 mL以下時，酵母菌發酵旺盛，YMI-1、YMI-2、YMI-15、YMI-18、YMI-25、YMI-37酵母菌產氣充滿整個杜氏小管。葡萄糖濃度為75 g/100 mL時，YMI-1、YMI-2酵母菌發酵管內充滿1/2的氣體，YMI-15、YMI-18、YMI-25酵母菌發酵管內充滿3/4的氣體，產氣量減少，YMI-37酵母菌產氣充滿整個杜氏小管。當糖濃度為 80 g/100 mL時，YMI-1、YMI-2酵母菌杜氏小管中充滿1/2氣體，YMI-15、YMI-18、YMI-25酵母菌杜氏小管中充滿3/4氣體，YMI-37酵母菌在80 g/100 mL糖濃度下仍能起酵，發酵旺盛，產氣充滿整個杜氏小管。根據耐糖杜氏小管產氣結果說明YMI-37酵母菌耐糖性能較好。

表2　6株酵母菌發酵后的殘糖量

6株菌都能在含80 g/100 mL的葡萄糖培養基里利用葡萄糖生長，由于發酵培養液起始糖濃度相同， 殘留的葡萄糖越少，說明在高糖條件下，用于酵母菌生長和發酵的糖越多，酵母菌的發酵力越強，耐糖性越好，由表2可以看出，YMI-37酵母菌高濃度糖下殘留葡萄糖量為42 g/100 mL，相對于其他5株菌殘留的葡萄糖量最少，所以選擇發酵能力強、耐糖性能好的YMI-37酵母菌。

綜合耐糖杜氏小管產氣結果和生物傳感分析儀篩選出起酵速度快、發酵能力強、耐受糖度為80%的葡糖溶液的酵母菌YMI-37，對其進行生理生化鑒定。

2.3酵母菌鑒定結果

2.3.1YMI-37酵母菌特征觀察結果

將培養2 d的酵母菌分別制成水浸片在光學顯微鏡下觀察，如圖1b所示；又將酵母菌進行前處理后于掃描電鏡下觀察，如圖1c所示。酵母菌成細胞卵形、臘腸形，大小為(5.7～9.3)μm×(3.7～6.7)μm，出芽生殖。無菌操作下，挑取酵母菌斜面1環進行酵母菌平板劃線培養，28 ℃恒溫培養1 d后每天觀察，如圖1 a所示。菌落為奶酪狀，表面平滑，反光，乳白色，邊緣整齊。在玉米瓊脂平板上培養不產生假絲，子囊孢子圓形，無假菌絲。

圖1　YMI-37酵母菌的菌落與菌體形態 Fig.1　Morphology and colony of strain YMI-37

2.3.2生理生化鑒定結果

將培養好的種子液分別接入糖發酵管中、碳源發酵管中、氮源、產酸、類淀粉、脲酶試管中，28 ℃培養48 h，觀察實驗現象(表3)。

由表3可知,YMI-37酵母菌能夠發酵麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、棉籽糖，不發酵纖維二糖、半乳糖、松三糖、蜜二糖、阿拉伯糖、菊糖、可溶性淀粉；碳源同化麥芽糖、半乳糖、海藻糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、棉籽糖，不能同化阿拉伯糖、纖維二糖、、蜜二糖、肌醇、山梨糖、核糖、乳糖、赤蘚糖醇、山梨醇、甘露糖、松三糖、鼠李糖、可溶性淀粉；氮源同化硫酸銨、硝酸鉀、亞硝酸鈉。

由表4可知YMI-37酵母菌不產生類淀粉；不產酸；脲酶試驗為陰性；根據上述生理生化實驗結果，對照酵母菌的特征與鑒定手冊，初步確定該菌株為酵母菌屬的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

表3　生理生化試驗結果

注：“+”表示能同化；-”表示不能同化。

表4　YMI-37酵母菌其他同化結果

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性。

2.3.3分子生物學鑒定結果

2.3.3.1DNA的提取和PCR擴增

以NL1和NL4為引物，通過酵母菌的特異性PCR反應擴增，然后對所擴增出的酵母菌的PCR產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖2所示，擴增產生了單一的DNA片段條帶，以Marker對比顯示跑出的條帶在500～750 bp之間，擴增的產物無明顯的非特異的擴增現象，表明已經擴增出目的基因，結果見圖2。

圖2　YMI-37 26S rDNA D1/D2 基因擴增電泳圖Fig.2　YMI-37 26S rDNA D1/D2 gene amplification electrophoresis pattern

2.3.3.226S rDNA序列相似性

采用雙向測序的方法，對YMI-37酵母菌的26S rDNA D1/D2區域的序列進行測定，用Sequencher軟件拼接測得的DNA 序列，通過BLAST在GenBank核酸序列數據庫中進行同源序列搜索及相關信息檢索，結果見表5。結果表明，YMI-37酵母菌與GenBank數據庫中已知酵母的一些模式菌株Saccharomycescerevisiae具有100%的相似性。

表5　分離菌株26S rDNA序列相似性分析

2.3.3.3系統發育分析結果

為了研究YMI-37酵母菌與已知的模式菌株種屬之間的親緣關系和YMI-37酵母菌在系統發育的地位，采用校正后的YMI-37酵母菌的26S rDNA D1/D2 區域序列，保留YMI-37酵母菌可靠的 581 bp 序列，對YMI-37酵母菌進行系統發育分析，在GenBank核酸序列數據庫中進行YMI-37酵母菌已知酵母菌相應序列的相似程度的比較。根據搜索結果，分別得到12個種模式菌株26S rDNA Dl/D2區域序列，將分離菌與12個種模式菌株使用ClustalX 1.83排序[21]后使用MEGA three 3.1計算序列相似性，通過Neighbor-Joining 分析方法，制作系統發育樹[ 22]，并進行了1 000次bootstrap的統計學檢驗，見圖3。

圖3　YMI-37酵母菌和相關酵母模式菌株系統發育樹Fig.3　YMI-37 yeast and related yeast strains of yeast phylogenetic tree

由圖3可知，菌株YMI-37與模式菌株SaccharomycescerevisiaeNL9-9聚為一枝同源性最近支持率為100%，結合兩者D1/D2序列一致性為100%，YMI-37判斷為釀酒酵母Saccharomycescerevisiae。

2.4耐高糖YMI-37酵母菌的TEM觀察結果

不同糖濃度環境下，酵母菌的生命活動與滲透壓的變化有著密切的關系。當糖濃度高時細胞內部滲透壓小于外部環境，細胞內的細胞質、 細胞膜等會發生變化。為了研究YMI-37酵母菌在高糖度下細胞內的變化，用透射電鏡觀察了酵母菌分別在含18、40、80 g/100 mL葡萄糖濃度的YPD培養基中細胞的變化，以不耐高糖的酵母菌在葡萄糖濃度為10 g/100 mL的YPD培養基中細胞的變化作對照，結果見圖4。

圖4　YMI-37酵母菌在不同糖濃度下的TME的觀察結果Fig.4　YMI-37 yeast in different concentration of sugar TME of observations

由圖4可以看出，當培養基中葡萄糖的濃度為18 g/100 mL時，細胞質與細胞膜結合緊密，細胞內含有少量的液泡，當葡萄糖的濃度為40 g/100 mL時，細胞膜與細胞質之間出現鋸齒狀，細胞質與細胞膜結合緊密，細胞質的濃度變深，液泡的數量變多；當葡萄糖的濃度為80 /100 mL時，細胞膜與細胞質之間出現鋸齒狀，細胞質與細胞膜結合緊密，細胞質濃度變深，液泡變大，而不耐高糖的酵母菌，在葡萄糖的濃度為10 g/100 mL時，細胞內含有極少量的液泡，細胞質與細胞膜結合緊密，細胞壁厚表面圓滑無鋸齒狀。

綜上可知，YMI-37酵母菌隨著糖濃度的增加，細胞外部的滲透壓變大，細胞質的濃度變深，細胞內的液泡變大，細胞膜與細胞質結合緊密，細胞大小基本一致，說明YMI-37酵母菌對高滲應激反應存在的生理性防御反應，YMI-37酵母細胞具有適應不同糖度滲透壓環境的能力，當糖度滲透壓環境高時，細胞質濃度深，可以推測某些與調滲有關的物質可能增加，會在細胞內部積累一些特殊溶質使細胞內外的滲透壓保持平衡[23]。它們可以使細胞內的滲透壓增加，保持細胞膜內外的滲透壓平衡，來調節外界的滲透壓，保證細胞能在高糖環境條件下生長繁殖。同時從TEM圖片結果可知，細胞內液泡也有調節滲透壓的功能，糖濃度高細胞內的液泡變大，使菌體內外滲透壓達到平衡，以保證細胞能在高糖環境條件下生長繁殖[24]。同時在不同濃度下酵母菌的大小基本一致，說明YMI-37酵母菌沒有在高糖度滲透壓下，使細胞失水體積變小，失去細胞的完整性。由此可知YMI-37酵母菌對高糖環境有調節的能力，適合在高糖度下生長繁殖。

3　結　論

從蜂蜜中經過初篩、復篩，篩選出1株耐高糖酵母，可以在含80 g/100 mL 的葡萄糖培養基里生長，跟據細胞形態、菌落形態觀察、生理生化試驗、26S rDNA基因測序和TEM觀察綜合分析，初步確定該菌株為酵母菌屬的釀酒酵母Saccharomycescerevisiae。

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2(Lvyuan Bee Limited Corporation of Daxinganling, Jagedaqi 165000, China)

Isolation and screening of high sugar-tolerant yeast in the Northeast black bee linden honey and TEM observation

XU Wei1*，DU Jiao1，DU Juan1，XU Chun-hua2，MENG Qing-sheng2，Fu Da-wei1，WANG Wei1

1(School of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

A yeast strain was isolated from Northeast of China specialty linden honey. The resulting yeast strain was fermented with broth containing different grams of glucose and then the different performance was compared. One strain with resistance to 80 g/100mL of glucose was suitable for use in the brewing of honey and named as yeast YMI-37. TEM was used to observe the internal structure changes of yeast YMI-37 cells at different glucose concentrations. The physiological, biochemical and molecular biological characteristics of YMI-37 were identified. Based on the comprehensive analysis of the physiological and biochemical features and 26S rDNA gene sequencing, the strain was preliminarily identified asSaccharomycescerevisiaeof yeast genera.

yeast； high sugar-tolerance；linden honey；screening；appraisal

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608009

博士，教授(本文通訊作者，E-mail：xuw@hrbcu.edu.cn)。

黑龍江省應用技術研究與開發項目(GC13B205)

2016-01-04，改回日期：2016-03-18