黃曲霉寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在工業(yè)釀酒酵母CICC1346中的表達(dá)

康小龍,呂曉靜,黃清媚,熊春江,林蔣海,肖文娟,劉澤寰

(暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，生命與健康工程研究院分子生物研究中心，廣東 廣州，510632 )

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黃曲霉寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在工業(yè)釀酒酵母CICC1346中的表達(dá)

康小龍,呂曉靜,黃清媚,熊春江,林蔣海,肖文娟,劉澤寰*

(暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，生命與健康工程研究院分子生物研究中心，廣東 廣州，510632 )

通過(guò)重疊延伸PCR(gene splicing by overlap extension,SOE-PCR)擴(kuò)增黃曲霉寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因和釀酒酵母α-信號(hào)肽序列，定向重組到整合型表達(dá)載體pδRCMB中，并在CICC1346中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)；然后通過(guò)同源建模、利用分子模擬軟件Discovery Studio 4.1分析其蛋白結(jié)構(gòu)，以對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG)為底物，建立并確定酶活反應(yīng)條件，并進(jìn)行純化、酶學(xué)性質(zhì)分析；將密碼子優(yōu)化后序列在CICC1346中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，利用淀粉進(jìn)行共發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：重組酶突變后相對(duì)野生型蛋白結(jié)構(gòu)無(wú)影響。SDS-PAGE分析重組重組酶大小約為70 kDa；優(yōu)化后最高酶活達(dá)到0.69 U/mL，重組酶最適pH為6.5，在pH4.5.0～7.0維持90%以上的酶活；最適溫度為40 ℃，在30～40 ℃維持接近100%的酶活；受Cu2+和Mn2+嚴(yán)格抑制；寡聚-1,6-葡萄糖苷酶與α-淀粉酶及糖化酶協(xié)同利用淀粉產(chǎn)乙醇，提高淀粉水解效率。這是首次報(bào)道黃曲霉的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在釀酒酵母整合型分泌表達(dá)。

釀酒酵母；黃曲霉；重疊延伸PCR(splicing by overlap extension,SOE-PCR)；同源建模；寡聚-1,6-葡萄糖苷酶；淀粉

淀粉是由葡萄糖為基本單位聚合而成的多糖，是自然界中含量最豐富的碳水化合物之一。淀粉鏈主要由α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵連接葡萄糖單元而成。其中，α-1,6-糖苷鍵只占總糖苷鍵很少比例,卻是淀粉鏈形成分支結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵。α-1,6-糖苷鍵限制淀粉被酶水解效率，加入α-1,6-糖苷水解酶( 即淀粉脫支酶)，可有效地提高淀粉原料的利用率及生產(chǎn)效率[1]。水解淀粉α-1,6-葡萄糖苷鍵的酶，也稱為解支酶(淀粉脫支酶, Debranching enzyme)，包括寡聚-1,6-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.10, Oligo-1,6-glucosidase)、普魯蘭酶( EC 3.2.1.41, Pullulanase),異淀粉酶(EC3.2.1.68, Isoamylase)、支鏈淀粉-6-葡聚糖水解酶( EC3.2.1.69, Amylopectin-6-glucanohydrase)等。寡聚-1,6-葡萄糖苷酶可釋放α-1→6連接的葡萄糖[2-3]。在工業(yè)生產(chǎn)葡萄糖中，通過(guò)寡聚-1,6-葡萄糖苷酶(又稱為異麥芽糖酶)可降解其副產(chǎn)物異麥芽糖，提高葡萄糖產(chǎn)率[4]。目前，對(duì)寡聚-1,6-葡萄糖苷酶研究主要集中在：將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、熱葡糖昔酶芽胞桿菌(BacillusthermoglucosidasiusKP1006)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)等細(xì)菌來(lái)源的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌(Escherichiacoli)或畢赤酵母中(Pichiapastoris)表達(dá)[5-7]；或?qū)H13家族中寡聚-1,6-葡萄糖苷酶與新普魯蘭酶進(jìn)行定性、分類研究[8]；以及利用其降解異麥芽糖的特性，提高對(duì)葡萄糖耐受性應(yīng)用到工業(yè)葡萄糖生產(chǎn)中，以提高葡萄糖產(chǎn)率[4]。

統(tǒng)合生物工藝(consolidated bioprocessing，CBP)是將酶的生成、底物降解以及產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化等一系列的生物催化過(guò)程由一種或一組微生物在一個(gè)反應(yīng)器能完成，具有簡(jiǎn)便、節(jié)省工藝、減少商業(yè)酶添加等優(yōu)點(diǎn)[9- 10]。其中，以釀酒酵母為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)了多酶表達(dá)，并開(kāi)展了“纖維素-乙醇”[11]、“淀粉-乙醇”的生物統(tǒng)合工藝研究[12]。研究人員嘗試在釀酒酵母中通過(guò)共表達(dá)淀粉酶、糖化酶、以及脫支酶實(shí)現(xiàn)對(duì)“一步法降解淀粉”[13-15]。而作為脫支酶的一種，在釀酒酵母中表達(dá)寡聚-1,6-葡萄糖苷酶，并以此基礎(chǔ)探究其對(duì)淀粉降解輔助作用研究的較少。因而，本實(shí)驗(yàn)嘗試在工業(yè)釀酒酵母CICC1346(“臺(tái)灣396”)[16]中通過(guò)YEp型(整合型)載體[17]實(shí)現(xiàn)寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的異源表達(dá)，并通過(guò)密碼優(yōu)化提高酶活，并研究了寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的酶學(xué)特性、利用淀粉共發(fā)酵等。這是報(bào)道中首次成功將黃曲霉的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

釀酒酵母菌株CICC1346購(gòu)于CICC、重組酵母pδRCMB-amy-ga為本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建[18]；黃曲霉菌株S7由本校食品學(xué)院饋贈(zèng)；大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保藏；載體pMD19-T購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司;載體pδRCMB為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建(啟動(dòng)子Ppgk1，終止子Tpgk1)。

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10，pH 7.0，添加終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素；在37 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)，篩選E.coli轉(zhuǎn)化子。YPD培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20、酵母粉10、葡萄糖20，添加終質(zhì)量濃度為300 μg/mL的氨基糖苷類抗生素G418；在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)，篩選酵母轉(zhuǎn)化子。PDA 培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200、葡萄糖20、瓊脂15～20、去離子水1 000 mL，自然pH；在30℃，150 r/min條件下培養(yǎng)黃曲霉。可溶性淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基：將7.5 g可溶性淀粉溶解于pH5.5的50 mL緩沖液中，補(bǔ)加2%的蛋白胨。

pNPG(對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷)購(gòu)自阿拉丁公司；肽N-糖苷酶F(PNGase F)，購(gòu)自NEB。

1.2方法

1.2.1常規(guī)分子生物學(xué)操作

大腸桿菌感受態(tài)制備，質(zhì)粒的提取、酶切、純化，載體與DNA片段的連接，酵母基因組提取等方法見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。

1.2.2引物設(shè)計(jì)

重疊延伸PCR(OverlapPCR)、PCR驗(yàn)證相關(guān)引物合成，由Invitrogen公司完成，具體見(jiàn)表1。

表1　引物序列

注：下劃線標(biāo)注的為限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列。

1.2.3mfα(α-信號(hào)肽序列)和oli(oligo-1,6-glucosidase)及m-oli基因的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank釀酒酵母Mf(alpha)信號(hào)肽序列(NCBI登錄號(hào):NM_001184001.1 I:296148471)，以MFαF和MFαR為引物擴(kuò)增出276 bp的mfα。根據(jù)黃曲霉NRRL3357的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因(NCBI登錄號(hào)：NW_002477249.1)序列(經(jīng)Sinal 4.1軟件在線檢測(cè)，無(wú)信號(hào)肽序列)，設(shè)計(jì)引物以黃曲霉菌株S7基因組DNA為模板，通過(guò)重疊延伸PCR去除內(nèi)含子，將外顯子片段拼接在一起。密碼子優(yōu)化序列(m-oli)則根據(jù)擴(kuò)增出的oli序列及其對(duì)應(yīng)氨基酸序列，由金唯智生物公司合成。

1.2.4質(zhì)粒pδRCMB-oli和pδRCMB-m-oli的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

利用重疊延伸PCR技術(shù)將α信號(hào)肽分別與黃曲霉oli基因、m-oli基因拼接，得到oli、m-oli，在進(jìn)行TA克隆，雙酶切驗(yàn)證，測(cè)序。隨后將mfα-oli分別連接到pδRCMB上，得到質(zhì)粒pδRCMB-oli和pδRCMB-m-oli。重組質(zhì)粒利用醋酸鋰電轉(zhuǎn)化法[19-20]，分別轉(zhuǎn)入工業(yè)釀酒酵母菌株CICC1346，利用 G418抗性平板篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子提取其基因組，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.5同源建模與DS4.1軟件模擬突變分析突變影響

經(jīng)Blastn比對(duì)查找相似序列，對(duì)其晶體蛋白分子的重原子骨架RMSD(均方根偏差)分析，通過(guò)Discovery Studio 4.1(生物信息學(xué)分析由暨南大學(xué)姚東升課題組協(xié)助分析)進(jìn)行建模、虛擬突變和分子動(dòng)力學(xué)模擬等得出氨基酸突變影響。

1.2.6超濾、凝膠層析分離以及N-糖基化分析

利用PALL的超濾離心管對(duì)發(fā)酵上清液總分泌蛋白進(jìn)行超濾濃縮、分離，再利用PBS 緩沖液(pH6.5)在島津LC-20A(制備型)高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)系統(tǒng)進(jìn)行凝膠層析分離純化。使用NEB公司的肽N-糖苷酶F進(jìn)行N-糖基化，具體步驟參考其使用說(shuō)明。

1.2.7菌體生長(zhǎng)測(cè)定和酶活測(cè)定

利用分光光度計(jì)，測(cè)定OD600值，顯示菌體的生長(zhǎng)情況。

根據(jù)pNPG法測(cè)定寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶活[21]。以酶活力為指標(biāo)，設(shè)計(jì)了不同的底物濃度、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)時(shí)間下的重組酶酶活反應(yīng)的單因素實(shí)驗(yàn)，得出寡聚-1,6-葡萄糖苷酶最佳反應(yīng)條件為：4 mmol/L的底物pNPG，40℃反應(yīng)30 min。寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶活力單位定義為：在40 ℃，pH6.5的條件下，1 min時(shí)間水解1 μmolpNPG所需的酶量，以IU表示。

1.2.8利用淀粉共發(fā)酵

α-淀粉酶和糖化酶以及脫支酶在利用淀粉時(shí)具有協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了重組了低聚-1,6-糖苷酶的釀酒酵母(CICC1346/p&-m-oli)外加的α-淀粉酶(5 IU/g)和糖化酶(10 IU/g)、重組淀粉酶基因和糖化酶基因的重組釀酒酵母(CICC1346/p&-amy-ga)外加的重組低聚-1,6-糖苷酶(5 IU/g)等利用淀粉共發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，同時(shí)以釀酒酵母CICC1346、釀酒酵母(CICC1346/p&-m-oli)作為對(duì)照組進(jìn)行研究。重組重組釀酒酵母(CICC1346/p&-amy-ga)經(jīng)測(cè)定其α-淀粉酶和糖化酶分別為1.10 IU/mL、1.89 IU/mL，重組釀酒酵母(CICC1346/p&-m-oli)低聚-1,6-糖苷酶0.60 IU/mL。

島津LC-15C高效液相色譜系統(tǒng)，A minex HPX-87H色譜柱對(duì)發(fā)酵乙醇進(jìn)行測(cè)定，α-淀粉酶與糖化酶活性測(cè)定分別參考王永剛[22]與李穎[23]的方法進(jìn)行操作。淀粉含量測(cè)定參考劉海林等[24]的方法。

2　結(jié)果與分析

2.1同源建模與DS4.1軟件模擬突變

基因測(cè)序后，經(jīng)Blastn分析，與已報(bào)道的黃曲霉NRRL3357的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因相比，一致性為99%，有8個(gè)核苷酸差異；經(jīng)Blastp分析，氨基酸序列在第41位、第314、第524位分別由Ile變?yōu)閂al，由Glu變?yōu)長(zhǎng)ys，Ala變?yōu)門hr；寡聚-1,6-葡萄糖苷酶與PDB庫(kù)中1UOK，3A47以及4M56的氨基酸序列的同一性和相似性均較高：同一性為32.2%，序列相似性為56.1%，可認(rèn)為具有同源性。寡聚-1,6-葡萄糖苷酶分子的第41、314和524位氨基酸并不處于保守區(qū)，突變前后殘基性質(zhì)相似，因此初步判斷突變對(duì)野生型酶的結(jié)構(gòu)影響不大。經(jīng)晶體蛋白分子的重原子骨架RMSD(均方根偏差)分析得知它們的三維結(jié)構(gòu)非常相似。因而，以1UOK、3A47和4M56的晶體結(jié)構(gòu)為模板對(duì)黃曲霉的寡聚-1，6-葡萄糖苷酶分子的氨基酸序列進(jìn)行同源建模，并進(jìn)行虛擬突變(如圖1所示)，其突變能值(Mutation Energy)為-0.16 kcal/mol，自由能值稍微小于野生型。因此，從突變能的角度預(yù)測(cè)該類型的突變對(duì)野生型寡聚-1，6-葡萄糖苷酶分子的結(jié)構(gòu)沒(méi)有影響。最后，通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬，平衡后的RMSD值均<2埃(蛋白骨架的RMSD值小于3埃的情況則認(rèn)為該結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的)，說(shuō)明突變后的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定且與野生型的相近。綜上，得出本研究中的氨基酸突變對(duì)寡聚-1,6-葡萄糖苷酶分子的結(jié)構(gòu)無(wú)影響。

A：野生型的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶蛋白結(jié)構(gòu)；B：突變后的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶蛋白結(jié)構(gòu)；第59、344和567位氨基酸殘基分別突變?yōu)槔i氨酸、賴氨酸和絲氨酸圖1　寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的蛋白結(jié)構(gòu)Fig.1　Protein structure of oligo-1,6-glucosidase

2.2寡聚-1,6-葡萄糖苷酶在重組工業(yè)釀酒酵母CICC1346中表達(dá)

重組載體pδRCMB-oli、pδRCMB-m-oli轉(zhuǎn)入CICC1346后，以重組釀酒酵母基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析表明(如圖2所示)經(jīng)密碼子優(yōu)化后的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因已成功轉(zhuǎn)入工業(yè)釀酒酵母CICC 1346(選取陽(yáng)性菌株進(jìn)行酶活測(cè)定)。

M-DNA Marker；1～3-CICC1346/ pδRCMB-oli的PCR產(chǎn)物；4～5-CICC1346/pδRCMB-m-oli6：陽(yáng)性對(duì)照；7-陰性對(duì)照?qǐng)D2　重組釀酒酵母的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2　Agarose gel analysis of PCR product of m-oli gene from recombinant yeast

利用NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)在線檢測(cè)，重組寡聚-1,6-葡萄糖苷酶只在第109位氨基酸可能會(huì)發(fā)生N-糖基化。N-糖基位點(diǎn)經(jīng)去糖基化酶作用后蛋白大小無(wú)明顯變化，可能重組酶糖基化水平低。純化后重組寡聚-1,6-葡萄糖苷酶經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)(如圖3所示)，重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-oli、重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-m-oli如圖3中 A、B泳道在約70 kDa處(預(yù)測(cè)重組蛋白分子約為68.65 kDa)均有明顯的條帶，證明重組酶成功在釀酒酵母CICC1346中表達(dá)。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白；A-重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-oli；B-重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-m-oli圖3　重組寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE分析Fig.3　SDS-PAGE analysis of heterologous recombinant oligo-1,6-glucosidase

2.3重組釀酒酵母生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲線

對(duì)重組釀酒酵母進(jìn)行生長(zhǎng)和產(chǎn)酶分析，由圖4可知，重組寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的合成屬于生長(zhǎng)偶聯(lián)型，約在60 h達(dá)到平臺(tái)期。而經(jīng)密碼子優(yōu)化后，重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-m-oli分泌最高酶活約為0.69 U/mL，而未有優(yōu)化重組酶最高約為0.16 U/mL，約提高了4.3倍。

■-重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-m-oli的生物量(OD600)；▲-重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-oli生物量的(OD600)；□-重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-m-oli的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶活；△-重組釀酒酵母CICC1346/pδRCMB-oli的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶活圖4　重組釀酒酵母的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲線Fig.4　Growth and oligo-1,6-glucosidase biosynthesis curve of recombinant yeasts

2.4重組寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶學(xué)特性

由圖5-A可知，重組釀酒酵母的重組酶的最適pH是在pH6.5，黃曲霉的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的也在pH6.5。由圖5-B可知，在pH4.5～7.0時(shí)，寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶活力較穩(wěn)定，維持90%以上的酶活；當(dāng)pH值大于7.5時(shí)，酶活力受到抑制。由圖5-C可知，寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的最適溫度為40 ℃。由圖5-D可知，在低于40 ℃時(shí)酶活力能夠較好地保持，基本達(dá)到了100%的酶活力。而當(dāng)在50℃以上時(shí)，重組酶和野生型的酶穩(wěn)定性均迅速下降。

A：pH對(duì)寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶活力的影響；B：pH對(duì)寡聚-1,6-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性的影響;C：溫度對(duì)寡聚-1,6-葡萄糖苷酶活力的影響；D：溫度對(duì)寡聚-1,6-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性的影響圖5　寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的酶學(xué)特性Fig.5　Characterization of recombinant oligo-1,6-glucosida

由圖6可知，在10 mmol/L的離子濃度，選取的金屬離子中Cu2+和Mn2+對(duì)寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶活抑制明顯，酶活性下降到10%以下，而其他的金屬離子Mg2+、Ca2+以及Ba2+對(duì)寡聚-1,6-葡萄糖苷酶酶活有促進(jìn)作用。

圖6　金屬離子對(duì)寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的影響Fig.6　Effect of 10 mM metal ions on the activity of oligo-1,6-glucosida

2.5重組釀酒酵母利用淀粉共發(fā)酵產(chǎn)乙醇

如圖7-a所示，釀酒酵母CICC1346和重組低聚-1,6-糖苷酶釀酒酵母(CICC1346/pδ-m-oli)基本不能利用可溶性淀粉，低聚-1,6-糖苷酶作用于支鏈的支點(diǎn)α-1,6-糖苷鍵，無(wú)法直接利用淀粉；而重組釀酒酵母(CICC1346/pδ-m-oli)以及釀酒酵母CICC1346，在外加淀粉酶和糖化酶能夠利用淀粉；二基因重組釀酒酵母(CICC1346/pδ-amy-ga)也能利用淀粉。因而，如圖7-b所示，釀酒酵母CICC1346和重組低聚-1,6-糖苷酶釀酒酵母(CICC1346/pδ-m-oli)菌體生長(zhǎng)較差，增加約2個(gè)OD600(利用種子液殘留少量葡萄糖)；其余實(shí)驗(yàn)組能夠利用可溶性淀粉，生長(zhǎng)速率接近，最終OD600約為19。

a：淀粉消耗曲線；b：菌體生長(zhǎng)曲線；c：乙醇生產(chǎn)曲線圖7　重組釀酒酵母利用淀粉共發(fā)酵產(chǎn)乙醇Fig.7　Growth curve, time courses of starch hydrolysis and ethanol production via fermentation from starch

如圖7-c所示，外加了α-淀粉酶和糖化酶后的釀酒酵母CICC1346和重組釀酒酵母(CICC1346/pδ-m-oli)生成乙醇速率最快，且外加酶的重組釀酒酵母(CICC1346/pδ-m-oli)乙醇濃度略高于外加酶釀酒酵母CICC1346。外加酶時(shí)，酶量相對(duì)較多，能夠迅速降解底物，相應(yīng)乙醇產(chǎn)率較快，且低聚-1,6-糖苷酶與α-淀粉酶和糖化酶協(xié)同作用淀粉底物；二基因重組釀酒酵母(CICC1346/pδ-amy-ga)與其在外加了低聚-1,6-糖苷酶的乙醇產(chǎn)率接近，脫支酶(包括低聚-1,6-糖苷酶)在支鏈的分枝點(diǎn)足夠多時(shí)作用效果才明顯，這需要足量的α-淀粉酶和糖化酶；而釀酒酵母CICC1346和重組釀酒酵母(CICC1346/pδ-m-oli)可能利用種子液殘?zhí)牵a(chǎn)少量的乙醇(少于0.5 g/L)。

3　討論

寡聚-1,6-葡萄糖苷酶是專一性水解α-1,6-葡萄糖苷鍵的水解酶, 它偏愛(ài)短鏈的寡糖底物,在動(dòng)物腸道參與碳水化合物的代謝[25]，參與寡糖底物的進(jìn)一步降解利用。寡聚-1,6-葡萄糖苷酶作為“淀粉脫支酶”的一種，屬于間接性脫支酶，它不直接作用于分支點(diǎn)的α-1,6-糖苷鍵，是能從多糖的非還原端水解解α-1,6-葡萄糖苷鍵的外切酶[5]。國(guó)內(nèi)外多將芽孢桿菌屬來(lái)源的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶克隆到大腸桿菌或畢赤酵母里實(shí)現(xiàn)異源性表達(dá)[2, 6, 25]，而較少采用真核生物來(lái)源的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶進(jìn)行異源性表達(dá)，也尚未在釀酒酵母里實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)。蔣思婧等將枯草芽孢桿菌來(lái)源的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶在畢赤酵母中進(jìn)行誘導(dǎo)后表達(dá)，酶活能夠達(dá)到0.34～2.2 U/mL[2]。本文首次將黃曲霉來(lái)源的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在釀酒酵母里實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，經(jīng)密碼子優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)菌株其酶活最高可以達(dá)到0.69 U/mL。

本文實(shí)現(xiàn)了首次將黃曲霉來(lái)源的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因通過(guò)δ整合方式在釀酒酵母里分泌表達(dá)，而δ整合是通過(guò)同源重組方式將目的基因穩(wěn)定的整合到酵母染色體，不易丟失目的基因，被認(rèn)為是工業(yè)上采用的主要重組方式，可減少利用抗生素等進(jìn)行抗性篩選[26-27]。本文在實(shí)現(xiàn)了在釀酒酵母中分泌表達(dá)黃曲霉的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶的基礎(chǔ)上，并利用淀粉進(jìn)行共發(fā)酵實(shí)驗(yàn)探索其輔助淀粉酶、糖化酶降解淀粉的作用。希望以后通過(guò)分子生物學(xué)方法定向改造其酶學(xué)特性或提高其酶活，構(gòu)建三基因共表達(dá)的重組菌株以真正實(shí)現(xiàn)對(duì)支鏈淀粉的統(tǒng)合生物加工工藝。

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Cloning and expression of oligo-1,6-glucosidase fromAspergillusflavusin industrialSaccharomycescerevisiaeCICC 1346

KANG Xiao-long,LV Xiao-jing, HUANG Qing-mei,XIONG Chun-jiang,LIN Jiang-hai,Xiao Wen-juan,Liu Ze-huan*

(Research Center for Molecular Biology, Institutes of Life and Health Engineering,College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632，China)

The oligo-1,6-glucosidase gene fromAspergillusflavuswas cloned and heterologously expressed in industrialSaccharomycescerevisiaeCICC 1346.Theopen reading frame(ORF)of oligo-1,6-glucosidase gene and the sequence of α-signal ofS.cerevisiaewas splicing by overlap extension (SOE-PCR), and ligated into the integrative expression vector pδRCMB and then was functionally expressed in industryS.cerevisiaeCICC1346.The protein structure of recombinant oligo-1,6-glucosidase was analysised by homology modeling and molecular modeling software Discovery Studio 4.1. We tried to build enzyme activity determination conditions which suit forrecombinant oligo-1,6-glucosidase byp-nitrophenyl-α-D-glucose-pyran-glycosides(pNPG), and then the enzyme characterizations were analysed and purificated. Analysising by DS4.1 and the result showed that the structure of recombinal oligo-1,6-glucosidasedoes not changed. The protein is probably an apparent molecular mass about 70 kDa as judged from mobility in SDS-PAGE gels .The results of enzymatic characterization showed that the temperature and optimal pH for enzyme reaction was pH 6.5 and 40 ℃ respectively, and stability and activity (>90% ) at pH4.5-7.0, stability and activity (>100%) at 30-40 ℃, strongly inhibited by Cu2+and Mn2+. The highest activity for the recombinant oligo-1,6-glucosidase reached 0.69 U/mL. The result of starch-fermentation showed thatthe synergism of recombination oligo-1,6-glucosidase and α-amylase and glucoamylase on hydrolyzing starch for ethanol production, which could improve the efficiency of starch hydrolysis .The heterologous expression of oligo-1,6-glucosidase fromA.flavus，S.cerevisiaein was first reported．

Saccharomycescerevisiae；Aspergillusflavus； splicing by overlap extension-PCR (SOE-PCR)； homology modelling； oligo-1,6-glucosidase; starch

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608008

碩士研究生(劉澤寰研究員為通訊作者，E-mail:zhliu@jnu.edu.cn)。

2015-07-28，改回日期：2016-04-12