肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶基因沉默對高山被孢霉脂質(zhì)積累的影響

楊華，陳海琴，郝光飛，顧震南，陳衛(wèi)，陳永泉

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

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肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶基因沉默對高山被孢霉脂質(zhì)積累的影響

楊華，陳海琴*，郝光飛，顧震南，陳衛(wèi)，陳永泉

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

高山被孢霉是一種工業(yè)化生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的產(chǎn)油真菌。通過分析高山被孢霉脂肪酸氧化途徑中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(carnitine acyl-transferase，CAT)基因與高山被孢霉脂肪酸氧化緊密相關(guān)，進(jìn)一步利用RNA干擾技術(shù)實(shí)現(xiàn)在高山被孢霉中CAT基因的沉默，分析發(fā)現(xiàn)，在高山被孢霉重組菌中，CAT活性下調(diào)了33.3%，總脂肪酸積累量相比野生型菌株提高38.1%，表明通過抑制β氧化途徑可以提高高山被孢霉的脂質(zhì)積累量，這為推動(dòng)高山被孢霉在脂質(zhì)生物合成工業(yè)化方面的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

β氧化；高山被孢霉；RNA干擾；肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶

多不飽和脂肪酸(PUFAs)是指含有2個(gè)或2個(gè)以上雙鍵、碳原子數(shù)為16-26的直鏈脂肪酸。PUFAs是人體所必需的脂肪酸，具有調(diào)節(jié)血脂[1]，清理血栓[2]，調(diào)節(jié)免疫功能[3]，健腦補(bǔ)腦[4]等作用，對人類和動(dòng)物的營養(yǎng)與健康具有十分重要的意義。由于傳統(tǒng)來源的PUFAs已經(jīng)無法滿足日益增長的市場需求，所以能夠積累多不飽和脂肪酸的微生物日漸成為食品、醫(yī)藥和化工領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5]。高山被孢霉(Mortierellaalpina)是一種工業(yè)化生產(chǎn)花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)的產(chǎn)油真菌，可以以甘油三酯形式積累多種多不飽和脂肪酸，已經(jīng)通過正式安全性評(píng)估[6]，是脂質(zhì)生物化學(xué)基礎(chǔ)研究的重要模式菌[7-9]。

以往對于產(chǎn)油微生物脂質(zhì)積累的研究多集中于過表達(dá)脂肪酸合成途徑的相關(guān)基因(如乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸合成酶)來增加脂質(zhì)產(chǎn)量，而脂肪酸氧化途徑也是維持脂肪酸貯存與消耗動(dòng)態(tài)平衡的重要步驟[10]，從代謝工程的角度來看，通過阻斷脂肪酸氧化途徑，也可以提高脂質(zhì)的產(chǎn)量。肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(carnitine acyl-transferase，CAT)在脂肪酸氧化途徑中起著重要作用。脂酰輔酶A不能直接通過線粒體和過氧化物酶體膜，而CAT能夠催化脂酰輔酶A生成?；鈮A，?；鈮A能夠穿過線粒體或過氧化物酶體膜，從而實(shí)現(xiàn)脂肪酸在線粒體和過氧化物酶體內(nèi)外的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)β氧化的進(jìn)行。研究發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)CAT活性或提高CAT表達(dá)量均可促進(jìn)脂肪酸的β氧化[11]，如在小鼠的飲食中加入L-肉毒堿可促進(jìn)體內(nèi)CAT的轉(zhuǎn)錄，改善因衰老引起的氧化效率降低現(xiàn)象[12]，亦可以明顯降低其細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量[13]。在微生物研究方面，高弘等[14]通過對熱帶假絲酵母β氧化過程轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的代謝工程改造，敲除CAT基因后，酵母的產(chǎn)酸和烷烴轉(zhuǎn)化率得到了明顯的提高。因此，我們推測CAT在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用，降低細(xì)胞內(nèi)CAT活性將有助于抑制β氧化過程，提高產(chǎn)油真菌的脂質(zhì)產(chǎn)量。本文采用了基因組信息比較全面[6]、遺傳操作系統(tǒng)相對成熟[7]的M.alpinaATCC 32222為原始菌株，通過分析高山被孢霉脂肪酸氧化途徑中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，選取在脂質(zhì)代謝中發(fā)生明顯變化的肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因?yàn)檠芯繉ο?，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法實(shí)現(xiàn)CAT基因的RNA干擾，提高重組菌株的脂質(zhì)能力，這對于產(chǎn)油真菌高山被孢霉的基礎(chǔ)理論研究及產(chǎn)品開發(fā)均具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1菌株及載體

大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)DH5α用于保藏重組載體，保藏于本實(shí)驗(yàn)室。購買于美國菌種保藏中心的高山被孢霉(M.alpinaATCC 32222)用于獲得目的基因。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株CCFM 501用于受體細(xì)胞。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)C58C1獲贈(zèng)于日本京都縣立大學(xué)Yasuyuki Kubo教授，用作介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。遺傳操作表達(dá)載體pBIG2-ura5s-Its來自本研究中心[7]。

1.2主要試劑

限制性內(nèi)切酶Hind III、KpnI、XmaI、XhoI(NEB公司，美國)，T4DNA連接酶(Promega公司，美國)，KOD plus 高保真DNA聚合酶(TOYOBO公司，日本)，TaqDNA聚合酶(康為世紀(jì)，中國)，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒(Fermentas公司，美國)，抗生素、飽和酚(上海生工，上海)，乙醇等化學(xué)試劑來自國藥，引物由上海桑尼公司合成。

1.3培養(yǎng)基

肉湯培養(yǎng)基，其組成為：20 g/L葡萄糖，5 g/L酵母提取物，1 g/L KH2PO4，0.25 g/L MgSO4·7H2O，10 g/L KNO3，pH 6.0。

MM培養(yǎng)基，其組成為：1.74 g/L K2HPO4，1.37 g/L KH2PO4，0.146 g/L NaCl，0.49 g/L MgSO4·7H2O，0.078 g/L CaCl2，0.002 5 g/L FeSO4·7H2O，0.53 g/L (NH4)2SO4，1.8 g/L葡萄糖，0.5%甘油，pH 6.8。

SC固體培養(yǎng)基組成為：20 g/L葡萄糖，5 g/L酵母氮源無氨基酸和硫酸銨，1.7 g/L (NH4)2SO4，60 mg/L異亮氨酸，60 mg/L亮氨酸，60 mg/L苯丙氨酸，50 mg/L蘇氨酸，40 mg/L賴氨酸，30 mg/L酪氨酸，20 mg/L腺嘌呤，20 mg/L精氨酸，20 mg/L組氨酸，10 mg/L甲硫氨酸，20 g/L瓊脂，pH 6.8。

需要時(shí)，向培養(yǎng)基中加入卡那霉素(Kanamycin，Kana)、氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)、利福平(Rifampicin，Rif)、尿嘧啶至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL，加入頭孢噻肟鈉(Cefotaxime Sodium，Cef)、壯觀霉素(Spectinomycin，Spe)至終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

1.4RNAi載體構(gòu)建

根據(jù)高山被孢霉M.alpinaATCC 32222的CAT1和CAT2基因序列信息，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物對，并添加酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，具體引物序列見表1，下劃線部分為酶切位點(diǎn)。以高山被孢霉cDNA為模板，用上述引物、KOD plus高保真DNA聚合酶，通過PCR對基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的片段。PCR擴(kuò)增片段經(jīng)純化后，與遺傳操作表達(dá)載體pBIG2-ura5s-Its酶切連接獲得RNAi載體。構(gòu)建流程如下，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α保藏，進(jìn)而通過電擊法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌C58C1，所得陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，-80 ℃下保存菌液，用于后續(xù)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

圖1　二元表達(dá)載體pBIG2-ura5s-CATs Silent的構(gòu)建Fig.1　Construction of binary vector pBIG2-ura5s-CATs Silent

表1　引物序列

注：下劃線表示酶切位點(diǎn)

1.5根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)高山被孢霉轉(zhuǎn)化

從-80 ℃冰箱中取出1.4中構(gòu)建成功的重組根癌農(nóng)桿菌，在100 μg/mL Kana和100 μg/mL Rif抗性的YEP液體培養(yǎng)基中活化，隨后與高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株CCFM 501共培養(yǎng)，利用含有100 μg/mL Spe和100 μg/mL Cef抗性的SC平板篩選陽性克隆。重復(fù)篩選3次，將穩(wěn)定遺傳的陽性菌株轉(zhuǎn)移至GY平板，培養(yǎng)至其產(chǎn)孢。用生理鹽水沖刷孢子，離心后保存在30%甘油中，-80 ℃冷藏。具體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化操作步驟參考文獻(xiàn)有關(guān)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法報(bào)道[15]。

1.6鑒定轉(zhuǎn)基因菌株

利用基因組提取試劑盒提取重組高山被孢霉的基因組DNA。 取1 μL DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定，根據(jù)遺傳操作表達(dá)載體pBIG2-ura5s-Its的啟動(dòng)子和終止子序列設(shè)計(jì)引物對HisproF1/TrpCR1(表1)[7]來驗(yàn)證表達(dá)單元是否成功整合到基因組上。PCR 條件為:95 ℃ 5 min預(yù)變性，95 ℃變性30 s、 55 ℃退火30 s、 72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7基因轉(zhuǎn)錄水平分析

使用Trizol法提取總RNA[6]。提取得到RNA溶液后，根據(jù)Prime ScriptTM1st Stand Sythesis試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。使用ABI-Prism 7900 sequence detection system (Applied Biosystems, CA) 按照SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA) 的說明進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：10 μL SYBR Green PCR Master Mix，兩種引物各0.5 μL，8 μL無酶水，1 μL模板。PCR循環(huán)設(shè)置為 50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以高山被孢霉自身的18S rRNA為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt法來分析基因表達(dá)的相對變化。

1.8肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶活性的測定

取0.2 g高山被孢霉菌體，加入液氮充分研磨至粉末，加入2 mL酶提取緩沖液(磷酸二氫鉀/氫氧化鉀緩沖液(pH 7.5)的質(zhì)量濃度為100 mol/L，苯甲脒鹽酸的濃度為1 mol/L，二硫蘇糖醇的濃度為1 mol/L，甘油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%)，吸取液體到1.5 mL離心管中，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，4 ℃，離心5 min，上清液即粗蛋白提取液，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)1.5 mL離心管中。

CAT酶活測定的原理主要是利用DTNB試劑與CoA反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，通過測定412 nm處可見光吸光度變化速率就可以計(jì)算出酶活性，具體方法參考文獻(xiàn)[16-17]。酶活以1 mg蛋白單位時(shí)間內(nèi)CoA的生成量表示。

1.9高山被孢霉菌體中脂肪酸組成及含量測定

稱取一定質(zhì)量真空冷凍干燥后的菌體，研磨充分至粉碎，并加入濃度為4 mol/L的HCl，在80 ℃/-80 ℃下反復(fù)凍融破壁。采用三氯甲烷和甲醇萃取總脂，氮吹后加入鹽酸甲醇溶液進(jìn)行甲酯化，隨后用正己烷萃取，得到的脂肪酸甲酯使用氣相檢測。具體實(shí)驗(yàn)操作見文獻(xiàn)[6]。

2　結(jié)果與討論

2.1β氧化途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

將高山被孢霉在5 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，選取氮源耗盡前后的時(shí)間點(diǎn)(A：8 h，B：18 h，E：19.5 h，K：21 h，L：32 h 和 M：68 h)進(jìn)行取樣，以E點(diǎn)時(shí)的樣品作為對照組[6]，分析β氧化途徑相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平，以確定其表達(dá)情況。如圖2，當(dāng)高山被孢霉處于脂質(zhì)積累階段時(shí)(K-L)，參與脂肪酸β氧化的脂酰輔酶A脫氫酶(EC 1.3.99)、烯酰輔酶A水合酶(EC 4.2.1.17)和3-羥脂酰輔酶A脫氫酶(EC 1.1.1.35)等的轉(zhuǎn)錄水平一直處于一個(gè)相對穩(wěn)定的狀態(tài)，而肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.7)基因表現(xiàn)出下調(diào)的趨勢，這可能是為了減少脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體進(jìn)行氧化[14]，從而保證了合成的甘油三酯能被很好地積累起來。而其中肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶2(CAT2)的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了較小幅度的上調(diào)，這可能是由于脂質(zhì)積累促進(jìn)了脂質(zhì)代謝的活躍程度。因此我們推測在高山被孢霉細(xì)胞內(nèi)，肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶與脂肪酸氧化緊密相關(guān)，故選定其作為研究對象。

A-8 h; B-18 h; E-19 h; K-21 h; L-32 h; M-68 h圖2　M. alpina中脂酰輔酶A脫氫酶、肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶、烯酰輔酶A水合酶和3-羥脂酰輔酶A脫氫酶的轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.2　Transcription levels of acyl-CoA dehydrogenase dehydrogenase, carnitine acetyltransferase, enoyl-CoA hydratase and 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase in M. alpina

2.2高山被孢霉CAT的基因沉默

2.2.1重組菌株的構(gòu)建及鑒定

以高山被孢霉cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段(圖3)，M為marker，1為CATsSF片段，2為CATsSR片段，與理論大小214 bp一致，并且測序驗(yàn)證正確。酶切連接獲得CAT沉默載體pBIG2-ura5s-CATsSilent，并通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法將載體的T-DNA區(qū)域整合到高山被孢霉基因組中。其中T-DNA區(qū)域包含兩個(gè)表達(dá)元件，作為篩選標(biāo)記的ura5表達(dá)元件和沉默CAT基因的表達(dá)元件。從篩選得到的能夠穩(wěn)定遺傳的陽性克隆中隨機(jī)挑選3株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果如圖4，M為marker，N為高山被孢霉野生型對照菌株，1、2、3分別為轉(zhuǎn)化的重組菌株。轉(zhuǎn)化菌株只能得到一條818 bp的條帶，為尿嘧啶基因表達(dá)元件，另一個(gè)表達(dá)元件由于形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)而無法通過PCR擴(kuò)增得到片段，同時(shí)，對照組無條帶，說明表達(dá)元件都已成功插入到高山被孢霉基因組，形成穩(wěn)定遺傳的重組菌株。

圖3　純化后的CATsSF和CATsSR基因片段Fig.3　Purification of CATsSF and CATsSR gene fragments

圖4　M. alpina重組菌的PCR鑒定Fig.4　Verification of M. alpina transformants by PCR

2.2.2轉(zhuǎn)化菌株中CAT基因表達(dá)量分析

分別取重組菌株和野生型菌株迅速置于液氮中，提取總RNA，分析CAT1和CAT2轉(zhuǎn)錄水平表明(圖5)，所有沉默重組菌株中肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)量均明顯低于野生型，CAT1和CAT2編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平均下降了40%左右，表明在重組菌株中實(shí)現(xiàn)了對CAT基因的沉默。

圖5　M. alpina重組菌株中肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄水平Fig.5　The transcriptional level of CAT in M. alpina transformants

2.2.3轉(zhuǎn)化菌株中CAT酶活分析

將選定的3株轉(zhuǎn)化子以及野生型高山被孢霉在100 mL肉湯培養(yǎng)基中28 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min培養(yǎng)7 d后，收集菌體，破碎菌體后進(jìn)行CAT酶活測定。結(jié)果如圖6所示，重組菌株CAT酶活水平相比對照菌下調(diào)33.3%左右，這表明通過RNAi可影響肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶的活性，本研究通過在高山被孢霉基因組中引入CAT基因的正向和反向特異性序列，使其轉(zhuǎn)錄后形成dsRNA來干擾高山被孢霉中CAT基因的轉(zhuǎn)錄量，進(jìn)而影響CAT酶活。

圖6　M. alpina重組菌株中肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶活性Fig.6　CAT activities in M. alpina transformants

2.3重組高山被孢霉轉(zhuǎn)化子脂肪酸的分析

將選定的3株CATs沉默菌株與野生型高山被孢霉在100 mL肉湯培養(yǎng)基中28 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min培養(yǎng)10 d后收集菌體，對脂肪酸含量進(jìn)行分析。如表2所示，相比于野生型高山被孢霉，重組菌株脂肪酸組成并沒有變化，這表明在高山被孢霉細(xì)胞內(nèi)，脂肪酸氧化代謝的發(fā)生對于脂肪酸碳鏈長度沒有偏好性。從表2可以看出沉默菌株生物量與對照菌相比沒有顯著差異，表明CAT酶的轉(zhuǎn)錄干擾對生物量影響極小。高山被孢霉在脂質(zhì)積累期內(nèi)脂肪酸氧化產(chǎn)生的能量主要用于多余熱量的產(chǎn)生[14]，因此CAT活性的降低不影響菌體的正常生長。但脂肪酸總量較野生型有所變化，在MA-CATs-S3沉默菌株中，脂肪酸的含量達(dá)到了細(xì)胞干重的38.4%，而對照菌株中的脂肪酸含量僅占細(xì)胞干重的27.8%左右，這表明CAT基因轉(zhuǎn)錄水平和酶活性的下降使脂肪酸的含量提高了約38.1%，是調(diào)控高山被孢霉脂肪酸氧化過程的重要酶，這也很好地驗(yàn)證了2.1中的轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果。綜合以上結(jié)果可以看出，在產(chǎn)油真菌高山被孢霉中，CAT的活性對維持細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化代謝的活躍程度十分重要，抑制其活性能夠抑制脂肪酸氧化過程，從而顯著提高細(xì)胞的脂質(zhì)積累。同時(shí)也應(yīng)該注意到，除了直接參與β氧化過程的酶之外，還存在著其他可以間接影響氧化代謝途徑的酶。過氧化物酶體生物合成因子(pex10)在最近被發(fā)現(xiàn)可能與脂肪酸合成密切相關(guān)，pex10的失活影響了解脂酵母細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸氧化過程，從而提高了脂質(zhì)產(chǎn)量[18]。然而，這些基因在高山被孢霉進(jìn)入脂質(zhì)積累期后并沒有發(fā)生明顯的變化，其作用仍需進(jìn)一步探討。

表2　高山被孢霉菌株脂肪酸組成

注：*表示與對照相比差異顯著。

3　結(jié)論

本文通過對高山被孢霉脂質(zhì)積累期參與β氧化的相關(guān)基因表達(dá)水平分析，預(yù)測出影響脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶，并成功構(gòu)建了高山被孢霉CAT基因沉默重組菌株，實(shí)現(xiàn)了肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶活性的降低，從而達(dá)到抑制脂肪酸氧化的目的，最終使高山被孢霉總脂肪酸含量提高約38.1%。這為提高高山被孢霉脂質(zhì)產(chǎn)量提供了新的思路，也為研究其脂質(zhì)合成代謝途徑提供了理論基礎(chǔ)。

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Effect of carnitine acyl-transferase suppression on fatty acid accumulation inMortierellaalpina

YANG Hua, CHEN Hai-qin, HAO Guang-fei, GU Zhen-nan,CHEN Wei, CHEN Yong-quan

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Mortierellaalpinais a type of fungus used for the industrial production of polyunsaturated fatty acids. Transcription levels of most of the β-oxidation-related genes were analyzed, and carnitine acyl-transferase was speculated to be the key enzyme involved in the oxidation. To suppress the oxidation of fatty acids, RNA interference technology was used to achieve gene silence of the key enzyme inMortierellaalpina. Enzyme activity analysis showed that the specific activity decreased by 33.3%. Lipid analysis revealed that there was a 38.1% increase in the fatty acid content compared to the wild-type, which indicated that suppression of β-oxidation could significantly increase fatty acid accumulation inMortierellaalpina. These results provided theoretical support for implications for industrial production of fatty acids inMortierellaalpina.

β-oxidation;Mortierellaalpine; RNA interference (RNAi); carnitine acyl-transferase

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608003

碩士(陳海琴教授為通訊作者，E-mail：haiqinchen@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金(21276108)。

2016-03-01，改回日期：2016-03-30