運動員腸道乳桿菌分離株對小鼠免疫功能的增強作用

劉志剛，馮海峰

山東農業大學體育與藝術學院，山東泰安271018

運動員腸道乳桿菌分離株對小鼠免疫功能的增強作用

劉志剛，馮海峰*

山東農業大學體育與藝術學院，山東泰安271018

為研究運動員腸道乳桿菌分離株對小鼠免疫功能的影響，本試驗用4周齡小白鼠作為實驗動物模型，將清潔級昆明小鼠（雌性）300只隨機分為5組（I～V），I組口服嗜酸乳桿菌，II組口服卷曲乳桿菌，III組口服鼠李糖乳桿菌，IV組口服唾液乳桿菌，濃度均為（1×1010cfu/mL），V組為對照組（不口服乳桿菌），每組10 mL/d，連續灌喂14 d，分別于口服乳桿菌后第3、7、14、21、28、35、42 d進行相關指標的檢測。試驗結果表明，嗜酸乳桿菌、卷曲乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和唾液乳桿菌均能提高小鼠血清抗體效價、小腸內IgA含量、淋巴細胞轉化率以及血清中IL-2含量，尤其以嗜酸乳桿菌效果最佳。結果證明了從運動員新鮮糞樣中分離到的優勢乳桿菌能顯著提高機體的體液免疫水平和細胞免疫水平，初步闡明了運動性胃腸綜合征的發病機制及運動員服用微生態制劑提升運動素質的機理。

運動員；腸道；乳桿菌；免疫功能

隨著微生物生態學研究的深入，證實定植在人和動物機體胃腸道內微生物菌群區系主要是由許多細菌組成，它們附著在腸內粘膜上，參與了機體的食物消化、藥物代謝、合成維生素和防止外源致病菌入侵腸道，對于維持機體健康和實現各種生理功能起著非常重要的作用，人體腸道內這些微生物與人體胃腸的功能關系密切［1］。

運動性胃腸綜合征是運動員常出現的一種訓練綜合征，是在高強度、大運動量的運動訓練和比賽中造成的機體胃腸功能紊亂的現象，而且也不同程度地妨礙了運動員正常的運動訓練和比賽［2，3］。前期對抽取的山東農大運動員腸道的正常菌群進行分離鑒定，對定植在胃腸道內的正常微生物區系進行研究，發現運動員腸道中的優勢菌群為嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）、卷曲乳桿菌（L.crispatus）、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）和唾液乳桿菌（L.salivarius）［4］。

乳酸桿菌是應用最早、應用歷史最長的微生物添加劑，也是機體腸道的優勢菌群之一，眾多研究表明它具有改善機體代謝、促進腸道有益菌增殖、抑制有害菌生長和增強機體免疫等作用。采用優勢菌群研制的微生態制劑口服液，運動員服用10 d后胃腸功能、運動持久力、抗感冒的能力均明顯增強，能更好地適應運動帶來的應急反應，抗疲勞能力增強0.7～1.1 h［4］，為了驗證其中的機理，本試驗以小白鼠為動物模型，將不同種類的乳桿菌給小白鼠口服來研究其免疫功能增強作用，為進一步闡明運動性胃腸綜合征的發病機制及提升運動員素質的機理提供科學的理論依據。

1　材料和方法

1.1菌株和實驗動物

嗜酸乳桿菌SL-1株，為從山東農業大學高水平運動員糞樣中分離到的菌株［4］；小白鼠為清潔級昆明小鼠，購自山東泰邦公司實驗動物中心。

1.2試劑

胎牛血清，鄭州佰安生物工程有限公司產品，批號201511003；羊抗鼠酶標二抗，購自晶美生物工程有限公司；鼠淋巴細胞分離液，購自上海浩本生物科技有限公司；伴刀豆素球蛋白（ConA），Amresco公司產品，用無血清RPMI 1640培養液配制成0.025 mg·mL-1，過濾除菌，分裝，-20℃保存；120370胃蛋白酶1：3 000Amresco分裝，活力單位3 000～3 500 U/mg；RPMI1640培養液，Gibco公司產品；PI染料，Amresco公司產品；ELISA試劑盒，IL-2檢測試劑盒，SIgA檢測試劑盒，均購自上海浩本生物科技有限公司。

1.3儀器

分光光度計，UV-1100型，上海美普達儀器有限公司產品；全自動血細胞分析儀，PE-6800VET型，深圳普康電子有限公司產品；流式細胞儀，Guava Technologies公司產品，型號GuagaEasyCyte Mini；Gene5酶標儀，ELX800型，美國Bio-Tek寶特公司生產。

1.4小鼠動物試驗設計和檢測指標

選取2周齡清潔級昆明小鼠（雌性）300只，放于室內適應環境1周，然后隨機分為4組（I～V），每組60只。試驗分組：I組口服嗜酸乳桿菌，II組口服卷曲乳桿菌，III組口服鼠李糖乳桿菌，IV組口服唾液乳桿菌，濃度均為（1×1010cfu/mL）；V組為對照組（不口服乳桿菌）。每組10 mL/d，連續灌喂14 d，在第3 d，每組均注射NDV疫苗。分別于免疫后第3、7、14、21、28、35、42 d對小鼠進行心臟采血，頸椎脫臼處死后取小腸，然后進行相關指標的檢測。

1.4.1抗體水平的檢測將每組血液樣本離心（2000 r/min，10 min），分離出血清。采用ELISA試劑盒檢測血清中NDV-IgG含量。

1.4.2小腸內SIgA的檢測對各組小鼠截取20 cm十二指腸至空腸段的小腸，加2 mL PBS充分研磨，離心取上清，用作一抗。按照SIgA ELISA試劑盒說明書步驟操作，測定OD 450 nm值。

1.4.3淋巴細胞轉化率的檢測無菌采取小鼠心臟抗凝血2 mL，沿試管壁緩緩加入含有2 mL鼠淋巴細胞分離液的試管中，1500 r/min離心20 min；吸取淋巴細胞層移入無菌離心管中，用RPM I 1640離心洗滌淋巴細胞3次（2000 r/min，15 min）；用臺盼藍拒染法檢測細胞活率＞95%，同時進行細胞計數。用RPM I 1640（含10%犢牛血清）調細胞濃度至1.0×108個/mL。將細胞懸液分加到96孔細胞培養板中，100 μL/孔，隨后加入ConA（終濃度25 μg/mL），同時設不加ConA的對照孔，置細胞培養箱培養48 h。然后每孔加入5 mg/mL MTT10 μL繼續培養4 h。細胞培養結束后，每孔再加DMSO 100 μL，于小型微量振蕩器上輕輕振蕩混勻約15 min，溶解各孔中沉淀物；于酶標儀上檢測490 nm波長下各孔的OD值，按下式計算：淋巴細胞轉化率（%）=（試驗孔平均OD值-對照孔平均OD值）/試驗孔平均OD值×100%。

1.4.4細胞因子IL-2的檢測按照小鼠IL-2ELISA試劑盒說明書要求檢測血清中IL-2的含量。

1.4.5數據處理數據以X±SD表示，用SPSS 11.0軟件進行Duncan多重比較分析。

2　結果

2.1小鼠血清抗體效價的變化

由表1可知，免疫后3 d，小鼠的抗體效價開始發生變化，嗜酸乳桿菌I組和鼠李糖乳桿菌III組在第21 d達到抗體高峰，而卷曲乳桿菌II組、唾液乳桿菌IV組和對照組V組在第28 d達到抗體高峰；從免疫后第7 d，口服各種乳桿菌試驗組I～IV組抗體滴度顯著高于對照組V組（P＜0.05），嗜酸乳桿菌I組、卷曲乳桿菌II組和鼠李糖乳桿菌III組顯著高于唾液乳桿菌IV組（P＜0.05）；免疫后7 d至第42 d，鼠李糖乳桿菌III組抗體水平高于卷曲乳桿菌II組，但差異不顯著。

表1　小鼠血清抗體效價Table 1 The serum antibody titer in NDV immune enhanced mice

2.2小鼠小腸內IgA含量的變化

表2　小鼠小腸內IgA含量的變化Table 2 The change of SIgA in the intestine of mice

由表2可見，從免疫后第3 d，小白鼠小腸內IgA含量開始變化，各個組均在21 d到達高峰值；嗜酸乳桿菌I組、卷曲乳桿菌II組、鼠李糖乳桿菌III組和唾液乳桿菌IV組均顯著高于對照組（V組）（P＜0.05）；I組IgA含量總體水平顯著高于II～IV組（P＜0.05），并且I～IV組IgA含量均高于下一組。

2.3小鼠淋巴細胞轉化率的變化

表3　小鼠淋巴細胞轉化率的變化Table 3 The transformation ratio of lymphocyte in mice

由表3可見，從免疫后第7 d，小白鼠淋巴細胞轉化率嗜酸乳桿菌I組、卷曲乳桿菌II組、鼠李糖乳桿菌III組和唾液乳桿菌IV組均顯著高于對照組（V組）（P＜0.05），各個組均在28 d到達高峰值；I組淋巴細胞轉化率顯著高于II～IV組（P＜0.05）；II～IV組淋巴細胞轉化率差異不顯著。

2.4小鼠血清IL-2含量的變化

表4　小鼠血清IL-2含量的變化Table 4 The change of IL-2 in mice（ng/L）

由表4可見，免疫后3 d小鼠血清IL-2含量開始發生變化，從免疫后第7 d，小鼠血清IL-2含量嗜酸乳桿菌I組、卷曲乳桿菌II組、鼠李糖乳桿菌III組和唾液乳桿菌IV組均顯著高于對照組（V組）（P＜0.05），各個組均在21 d到達高峰值；I組小鼠血清IL-2含量顯著高于II～IV組（P＜0.05）；II～IV組淋巴細胞轉化率差異不顯著。

3　討論

（1）人體的胃腸道是控制和調節適應和再生能力系統的一部分，平衡的胃腸免疫系統以及積極的免疫活性可以使運動員抵御有害病原體的侵害。在運動過程中，機體所發生的一系列的變化將會導致胃腸系統的功能及其結構的變化，降低胃腸道對體液及營養物質的吸收，導致脫水和能量貯存不足，從而影響運動員的運動能力［5，6］。近年來，隨著高校高水平運動員的增多，鍛煉項目及鍛煉強度的增加，運動員常常出現運動后身體不適，尤其是胃腸功能的問題［1］。胃腸微生物區系對維持運動員健康起著重要作用，而且與胃腸綜合征的發病有著一定的聯系［2，3］。本研究利用從山東農業大學高水平運動員新鮮糞樣中分離到的嗜酸乳桿菌、卷曲乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和唾液乳桿菌對小白鼠的免疫功能的影響研究，進一步揭示了高水平運動員胃腸道微生物區系與人體素質（免疫功能）的關系，為提高運動員的抵抗力、增強體質提供了動物實驗理論依據。

（2）本試驗選用4周齡小白鼠作為動物模型，小白鼠體型小，性情溫順，易于飼養管理、操作和觀察，對外來刺激和病原體均很敏感，此外，由于遺傳均一，個體差異小，試驗結果精確可靠，均有利于試驗研究。抗體效價的水平能直接反映機體體液免疫的狀態；sIgA是黏膜免疫應答過程中的主要體液因子，腸道中SIgA含量的變化直接反映機體黏膜的局部免疫狀態［7］；細胞免疫不僅參與胞內的免疫應答而且對體液免疫也有一定的調節作用，是抗感染免疫的主要力量；白細胞介素2（IL-2）主要由活化的T淋巴細胞產生的具有廣泛生物活性的細胞因子，是所有T細胞亞群的生長因子，并可促進活化B細胞增殖，誘導產生干擾素，增強單核細胞以及自然殺傷細胞（NK）的殺傷活性，在機體的免疫反應中具有重要的調節作用［8，9］；T淋巴細胞是機體細胞免疫功能的承擔者，它分泌各種介質并作用于其他淋巴細胞或巨噬細胞，行使信息傳遞、識別、效應等功能，是機體免疫反應的重要調節細胞［10-12］。試驗結果表明，嗜酸乳桿菌、卷曲乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和唾液乳桿菌均能提高小鼠血清抗體效價、小腸內IgA含量、淋巴細胞轉化率以及血清中IL-2含量。結果充分證明了從運動員新鮮糞樣中分離到的優勢乳桿菌能顯著提高機體的體液免疫水平和細胞免疫水平。

（3）前期研究發現農業大學運動員口服微生態制劑后明顯增強了運動員的抗應急、抗疲勞、抗感冒的能力，堅持服用微生態制劑可以明顯提高運動員的運動能力。本次研究以小白鼠為動物模型，將不同種類的乳桿菌給小白鼠口服來研究其免疫功能增強作用，進一步闡明了運動性胃腸綜合征的發病機制及運動員服用微生態制劑提升運動素質的機理。

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The Effect of Lactobacillus Isolated from the Athletes on the Immune Function of Mice

LIU Zhi-gang，FENG Hai-feng*
College of Sports and Art/Shandong Agricultural University，Taian 271018，China

In order to study the effect of Lactobacillus isolated from the athletes on the immune function of mice，female Kunming mice（4 weeks old）used in all experiments were divided into 5 groups（I～V）.The group I was immunized via oral with strain of Lactobacillus acidophilus；the group II was immunized via oral with strain of Lactobacillus crispatus；the group III was immunized via oral with strain of Lactobacillus rhamnosus；the group IV was immunized via oral with strain of Lactobacillus salivarius.All groups with the concentration of 1×1010cfu/mL.The group V was control group（Lactobacillus without oral administration）and the bacterial fluid was given by average（10 mL）for 14 days.The relevant indicators were detected after oral administration of Lactobacillus in 3，7，14，21，28，35 and 42 d.Test results showed that Lactobacillus acidophilus，Lactobacillus crispatus，Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus saliva could improve the serum antibody titer of mice，IgA content in small intestine，lymphocyte transformation rate and serum IL-2 content，especially with the best effect of Lactobacillus acidophilus.The Lactobacillus isolated from the fresh fecal samples could significantly improve the humoral and cellular immunity.The study preliminary clarified the pathogenesis of sports gastrointestinal syndrome and the mechanism of the athletes taking the micro ecological agents.

Athletes；intestinal；Lactobacillus；immune function

R378.2

A

1000-2324（2016）02-0177-04

2015-02-11

2015-05-01

山東星火計劃項目

劉志剛（1958-），男，副教授.研究方向為足球運動及陽光體育運動.E-mail：zhigang5807@sina.com

*同等貢獻作者：馮海峰（1962-），女，副教授.研究方向為小球類運動.