羅格列酮干預胰島素抵抗大鼠認知行為及AD樣病變的作用機制

尹黎英，劉志賢，寧青梅，陳　莉

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羅格列酮干預胰島素抵抗大鼠認知行為及AD樣病變的作用機制

尹黎英，劉志賢，寧青梅，陳莉

目的觀察胰島素抵抗大鼠認知行為及海馬阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)樣病理改變，研究羅格列酮(rosiglitazone，RSG)對其認知及AD樣病變的干預作用及可能的機制。方法建立胰島素抵抗大鼠模型，將成模的20只大鼠隨機分為胰島素抵抗(insulin resistance，IR)組和羅格列酮(RSG)組，每組10只,未造模的正常大鼠作為對照(CTL)組(n=10)。RSG組予高脂高糖高蛋白飲食+羅格列酮片3.0 mg/(kg·d)灌胃4周；IR組予高脂高糖高蛋白飲食+等量生理鹽水灌胃4周；CTL組予普通飲食+等量生理鹽水灌胃4周。觀察指標為各組大鼠血糖、血漿胰島素水平、胰島素抵抗指數(IRI)、水迷宮行為能力測定、海馬中IDE、pAKT、Aβ蛋白表達。結果IR組與RSG組胰島素抵抗指數(8.56±0.43和3.82±0.38)較CTL組(2.27±0.25)高，而RSG組低于IR組。IR組和RSG組大鼠第4天逃避潛伏期[(63.21±5.67)s和(37.48±5.41)s]較CTL組[(24.14±5.49)s]明顯延長；IR組和RSG組穿越原平臺象限時間占總時間百分比[(21.88±3.85)%和(33.43±2.98)% ]較CTL組[(39.57±4.31)%]減小，而RSG組較IR組明顯延長。IR組和RSG組Aβ40蛋白陽性表達(0.27±0.023和0.56±0.011)較CTL組(0.13±0.021)強，而RSG組較IR組弱。上述差異均有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。結論胰島素抵抗大鼠認知行為明顯下降，羅格列酮可改善其認知行為，減輕Aβ在海馬的沉積。其機制可能與通過胰島素通路PI3K/AKT介導的IDE上調，增強IDE對Aβ的降解相關。

羅格列酮；胰島素抵抗；阿爾茨海默?。灰葝u素降解酶

近年諸多研究證實，胰島素抵抗與阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的發生存在相關性[1]，2型糖尿病患者比健康人更易出現認知功能障礙及腦組織AD樣病變[2]。胰島素抵抗可加速神經纖維纏結、tau蛋白呈過度磷酸化，從而促進AD發生。那么胰島素抵抗是否與AD的另一病理改變，即Aβ在腦內的大量沉積相關，是本研究的主要目的之一。

Aβ在腦內的代謝失衡是導致其大量沉積形成老年斑的根本原因[3]。胰島素降解酶(insulin degrading enzyme，IDE)可降低Aβ的神經毒性，并減少其沉積。一方面，胰島素可以競爭性地與IDE結合，從而抑制了IDE對Aβ的降解；另一方面，IDE是胰島素信號通路PI3K/AKT下游的一個調節靶位，增強此通路可以上調IDE[4]。羅格列酮(RSG)已被證實可以激活PI3K/AKT通路，增強胰島素敏感性[5]。據此，筆者推測RSG可以通過激活PI3K/AKT通路，上調IDE，增強對Aβ的降解。因此，本研究基于如上理論，旨在進一步求證胰島素抵抗大鼠的認知行為改變及AD樣病變，并觀察RSG的干預效果及其作用機制。

1　材料與方法

1.1動物模型及分組健康雄性Wistar大鼠40只，體重180～220 g。隨機選取30只給予高脂高糖高蛋白飲食，熱量百分比為碳水化合物26%，蛋白質15.2%，脂肪(煉豬油)58.8%。另外10只給予普通飲食。3個月后，用血糖儀檢測大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)與胰島素(fasting insulin, FINS)水平，采用放射免疫法計算胰島素抵抗指數(insulin resistance index, IRI)并篩選出符合胰島素抵抗模型的大鼠(依據喂高糖高脂高蛋白飼料IRI大于普通飼料大鼠IRI均數加1.96個標準差)。將成模的20只大鼠隨機分為胰島素抵抗(IR)組和羅格列酮(RSG)組，每組各10只。RSG組予以高脂高糖高蛋白飲食+羅格列酮片3.0 mg/(kg·d)灌胃，持續4周；IR組予以高脂高糖高蛋白飲食+等量生理鹽水灌胃，持續4周。另外普通飲食的10只作為對照組(CTL)，等量生理鹽水灌胃4周。灌胃4 周后處死所有動物。大鼠飼養室溫為20 ℃，自由飲水，天黑前投食，自然晝夜節律光照。

1.2觀察指標及方法

1.2.1一般指標(1)血糖測定：處死前尾靜脈采血，用血糖儀檢測血糖水平。(2)血漿胰島素測定：處死前心臟取血1 ml，離心后留取血漿，用放射免疫法檢測胰島素的水平。藥盒購自北京原子能研究所，測定值批內 CV<2.5%,批間CV<3.5%。以IRI=FBG(mmol/L) ×FINS(U/L)/22.5表示胰島素抵抗指數。

1.2.2Morris水迷宮試驗灌胃第4周，各組大鼠在處死前5 d開始進行Morris水迷宮行為能力測試[6]。數據采集和處理由Morris水迷宮圖像自動監視處理系統完成。

1.2.3海馬中IDE、pAKT、Aβ蛋白表達的檢測

1.2.3.1制備腦組織切片灌胃4周后，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，打開胸腔，充分暴露心臟，于左心室插入灌注針并固定，剪開右心耳，200 ml生理鹽水快速持續灌洗，待右心耳可見清澈液體流出，然后改用4%多聚甲醛200 ml先快后慢灌注固定，直至大鼠肝臟變白，全身僵硬，快速斷頭取腦，置于4%多聚甲醛固定6 h,然后置于30%蔗糖溶液中脫水至組織塊下沉。用濾紙吸干腦表面蔗糖溶液,OCT液氮中包埋，-80 ℃凍存。將凍好的腦組織放入恒冷箱冰凍切片機做冠狀切片，厚度為10 μm,海馬部位的切片依次存放備用。

1.2.3.2MAP2、IDE、pAKT免疫熒光雙標染色冷凍海馬切片經室溫干燥、洗滌、封閉后加一抗，分別為兔抗IDE多克隆抗體(1∶2500)、兔抗pAKT多克隆抗體(1∶500)，4 ℃過夜；PBS洗滌后加二抗，羊抗兔-TRITC(1∶50),PBS洗滌后再加小鼠抗MAP-2(1∶500) 4 ℃過夜；PBS洗滌后加二抗，羊抗小鼠-FITC(1∶50)；最后PBS洗滌甘油封片，熒光顯微鏡下拍照。隨機選取海馬部位4個高倍視野，用Image Pro 5.0 Plus對IDE、pAKT的表達進行分析，并計算其平均灰度值。

1.2.3.3免疫組化檢測Aβ表達海馬切片常規經抗原修復，消除內源性過氧化物酶，滴加一抗：兔抗鼠Aβ(1-40)(1∶200)，4 ℃過夜；從冰箱取出后室溫放置20 min,PBS洗滌，加二抗：羊抗兔PV-6001,37 ℃溫箱孵育30 min,PBS洗滌。DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，沖洗，最后脫水，透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察神經細胞胞漿呈棕黃色為陽性，每張切片高倍鏡下選擇4個視野，并計算平均光密度值。

2　結　　果

2.1造模情況3個月不同飲食喂養后，3組之間的血糖比較，差異無統計學意義；IR組與RSG組胰島素水平及IRI較CTL組增高，差異有統計學意義(P<0.05)；RSG組胰島素水平及IRI較IR組低(P<0.01，表1)。

表1　3個月不同飲食喂養后3組大鼠一般指標的比較　(n=10；±s)

注：與對照組比較，①P<0.05，②P<0.01；與胰島素抵抗組比較，③P<0.01

2.2IDE/MAP-2、pAKT/MAP-2免疫熒光雙標染色IDE/MAP-2免疫熒光雙標染色可見，IR組及RSG組熒光強度較CTL組減弱，而RSG組較IR 組熒光強度則有所增強；pAKT免疫熒光的變化趨勢與IDE一致(圖1)。

2.3Morris水迷宮實驗前4 d的定位航行實驗中，各組大鼠的逃避潛伏期均呈下降趨勢；IR組和RSG組大鼠平均逃避潛伏期較CTL組明顯延長(P<0.01或P<0.05)；RSG組較IR組平均逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01)。第5天空間探索實驗IR組和RSG組較CTL組穿越原平臺象限時間占總時間百分比減小(P<0.01或P<0.05)；而RSG組較IR 組明顯增大(P<0.01，表2)。

圖1　3組大鼠海馬切片IDE、pAKT免疫熒光

2.4Aβ40蛋白表達鏡下見Aβ40陽性表達物為棕黃色顆粒(圖2)。IR組和RSG組Aβ40蛋白陽性表達平均光密度值(0.270±0.023和0.560±0.011)較CTL組(0.13±0.021)強，差異有統計學意義(P<0.01)；IR組和RSG組之間的差異也有統計學意義(P<0.01)。

表2　3組大鼠Morris水迷宮實驗比較　(n=10；

注：與對照組比較，①P<0.01，②P<0.05；與胰島素抵抗組比較，③P<0.01

圖2　大鼠海馬區Aβ40的免疫組化表達(×200)

3　討　　論

流行病學資料顯示，T2DM可以促進AD的發生[7]。T2DM以胰島素抵抗及高胰島素血癥為特征。胰島素抵抗是由于各種原因導致體內胰島素升高而其有效濃度及生物效能下降，從而導致的胰島素相對不足。胰島素的這種變化不僅存在于外周，同時也存在于中樞神經系統。腦內的胰島素可以通過其相應的胰島素受體發揮重要的生物學效應，如調節新陳代謝、促進神經組織生長發育、參與學習記憶等高級智能活動；而胰島素抵抗則可導致腦內細胞代謝紊亂，能量代謝障礙，從而使得學習記憶等智能活動受損并誘發AD樣病理級聯反應[8]。

本研究發現，通過持續予以大鼠高糖高脂高蛋白飲食3個月，血漿胰島素水平及IRI明顯升高，成功地建造了胰島素抵抗模型，并通過Morrir水迷宮實驗發現此類大鼠存在著認知行為的下降，并在大鼠海馬組織中檢測到大量的Aβ沉積，實驗結果進一步證實了胰島素抵抗可以發生AD樣癥狀及病理改變。Aβ的沉積與IDE的作用密切相關，IDE是其降解過程中的主要酶，高胰島素競爭性的與IDE相結合，從而抑制了IDE對Aβ的降解。本研究中也發現，胰島素抵抗大鼠血漿胰島素水平升高，腦中的IDE蛋白表達明顯減少，而Aβ的沉積明顯增多，與之前的研究結果相一致。如果可以提高腦內IDE的濃度，便可增加對Aβ的降解。研究人員證實IDE是腦內胰島素的信號傳導通路中的PI3K-PKB/AKT途徑下游的一個靶位，所以這條途徑的激活，可以對IDE起到上調作用[9]。

RSG是噻唑烷酮類化合物屬于胰島素增敏藥，在T2DM中的臨床治療中已得到認可。RSG可以與PPARr特異性結合，激活胰島素信號通路，改善胰島素抵抗和高胰島素血癥[2]。本研究結果表明，RSG組大鼠的血漿胰島素水平及IRI明顯下降，說明RSG可以對抗胰島素抵抗狀態；在進行了4周RSG灌胃后，發現PI3K-PKB/AKT通路上pAKT的上調，并同時檢測到大鼠海馬組織中IDE的蛋白表達增加及Aβ的沉積減少，說明RSG可以通過激活胰島素信號通路PI3K-PKB/AKT使得IDE上調，從而增加對Aβ的降解，減少其沉積，說明RSG對AD樣病變有減輕作用；另外Morrir水迷宮實驗檢測結果顯示，RSG組大鼠的認知行為較IR組明顯好轉，說明RSG對胰島素抵抗大鼠的AD樣癥狀有緩解作用。

綜上所述，本研究證實了胰島素抵抗大鼠可以發生AD樣病變和認知行為的改變。而在RSG的作用下，一方面可以通過激活腦內胰島素的信號傳導通路上調IDE，增加對Aβ的降解，減少其在腦組織的沉積，改善胰島素抵抗大鼠的認知行為；另一方面減輕了腦內的高胰島素血癥，使得Aβ與IDE的結合不會被胰島素競爭性地抑制，從而增加Aβ的降解減少其沉積。

[1]李欽云，陳征，張守字, 等. 126例阿爾茨海默病患者血脂代謝和胰島素抵抗的研究[J]. 中華全科醫學，2015，13(1)：15-17.

[2]楊雁，張曉潔，王玉萍，等. 噻唑烷二酮通過Wnt通路改善2型糖尿病大鼠海馬阿爾茨海默病樣病變[J]. 中國病理生理雜志，2010，26(12)：2421-2427.

[3]冉軍，王萍. 腦脊液tau蛋白聯合Aβ1～42在阿爾茨海默病診斷中的價值[J]. 中國老年學雜志，2015，35(10)：2697-2698.

[4]Fernández-Gamba A，Leal M C，Morelli L，etal. Insulin-degrading enzyme: structure-function relationship and its possible roles in health and disease [J]. Curr Pharm Des，2009，15(31)：3644-3655.

[5]Zhao L，Teter B，Morihara T，etal. Insulin-degrading enzyme as a downstream target of insulin receptor signaling cascade: implications for Alzheimer’s disease intervention [J]. J Neurosci，2004，24(49)：11 120-11 126.

[6]王俊亞，張冬梅. Morris水迷宮實驗的測試方法介紹及注意事項[J]. 現代醫藥衛生，2012，28(21)：3289-3290.

[7]楊文清，馬晶，宋曉征，等. 羅格列酮調節IDE和GSK-3β的活性改善阿爾茨海默病動物認知能力[J]. 重慶醫科大學學報，2013，38(6)：620-625.

[8]Darshini M，Kamal M A，Greig N H,etal. Alzheimer′s disease and type 2 diabetes: exploring the association to obesity and tyrosine hydroxylase [J]. CNS Neurol Disord Drug Targets，2012，11(4)：482-489.

[9]楊思思，姜騰，張木勛. 肥胖大鼠海馬內TNF-α、胰島素降解酶、PPARγ和Aβ的表達及其作用[J]. 中國病理生理雜志，2012，28(10)：1756-1760.

(2015-11-28收稿2016-01-10修回)

(責任編輯武建虎)

Mechanisms of rosiglitazone intervening in insulin resistance in cognitive-behavioral and AD-like lesion in rats

YIN Liying，LIU Zhixian, NING Qingmei, and CHEN li.

Department of Neurology, Shanxi Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Force, Taiyuan 030006, China

ObjectiveTo study the insulin resistance rat cognitive behavior and hippocampal Alzheimer disease (AD) - like pathological change, to study the intervention effect of rosiglitazone (RSG) on the cognitive and AD- like lesions and its possible mechanism. MethodsThe rat models of insulin resistance were established and 20 successful models were randomly divided into the insulin resistance(IR)group(n=10) and rosiglitazone (RSG) group, each group of 10,the normal rats as control (CTL)group(n=10).The rats in RSG group were given high-protein diet with high fat and sugar +RSG 3 mg/kg/d by gavage for 4 weeks. IR group were given high-protein diet with high fat and sugar + equivalent saline by gavage for 4 weeks.CTL group were given general diet + equivalent saline by gavage for 4 weeks. The observation indexes included the blood glucose,plasma insulin levels(FINS),insulin resistance index(IRI),Morris water maze test,insulin degrading enzyme (IDE),response to insulin sialing pathway of pAKT,and Aβ protein expression in hippocampus. ResultsThe IRI in IR group and RSG group(8.56±0.43 and 3.82±0.38)is low than that in CTL group(2.27±0.25),but in RSG group was lower than in IR group. The 4 day escape latency of rats in IR and RSG groups[(63.21±5.67)s and(37.48±5.41)s] was significantly longer than in CTL group [(24.14±5.49)s].The through the platform quadrant percentage of total time in IR and RSG groups [(21.88±3.85)% and (33.43±2.98)%] was smaller than in CTL group [(39.57±4.31)%],but RSG group is superior to IR group. The Aβ protein expressions in IR group and RSG groups (0.27±0.023 and 0.56±0.011)was stronger than that in CTL group(0.13±0.021), but RSG group is weaker than IR group. These differences were statistically significant (P<0.01 orP<0.05). ConclusionsInsulin resistance rats can develop cognitive behavior decrease and aβ deposition AD like pathological changes.RSG can improve the cognitive behavior, reduce the aβ in the hippocampus of deposition, its mechanism may be through the insulin pathway mediated by IDE PI3K/AKT,to enhance IDE of aβ, thereby reducing degradation deposition.

rosiglitazone; insulin resistance; Alzheimer′s disease; insulin degrading enzyme

尹黎英，在職研究生，主任醫師。

030006太原，武警山西總隊醫院神經康復科

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