亞低溫聯(lián)合高壓氧干預(yù)對大鼠神經(jīng)干細胞RhoA/RHOCK通路的影響

王東，付紅杰，張建軍，李超

(天津市第四中心醫(yī)院，天津300140)

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亞低溫聯(lián)合高壓氧干預(yù)對大鼠神經(jīng)干細胞RhoA/RHOCK通路的影響

王東，付紅杰，張建軍，李超

(天津市第四中心醫(yī)院，天津300140)

目的探討亞低溫聯(lián)合高壓氧干預(yù)通過RhoA/RHOCK通路對神經(jīng)干細胞凋亡、增殖、分化的影響。方法 制作大鼠神經(jīng)干細胞液壓損傷模型，并隨機分為4組。常溫組不進行任何干預(yù)；亞低溫干預(yù)組于傷后1 h進行(32±0.5)℃亞低溫治療4 h；高壓氧組予以高壓氧干預(yù)；聯(lián)合組在亞低溫干預(yù)同時予以高壓氧干預(yù)。采用免疫熒光檢測神經(jīng)干細胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR基因及蛋白表達，激光共聚焦顯微鏡根據(jù)熒光強度值計算神經(jīng)干細胞內(nèi)Ca2+濃度，TUNEL法檢測神經(jīng)干細胞凋亡情況。結(jié)果 體外損傷模型神經(jīng)干細胞造模后72 h，聯(lián)合組、高壓氧組、亞低溫組神經(jīng)干細胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR基因及蛋白表達較常溫組明顯降低(P均<0.05)，聯(lián)合組比高壓氧組、亞低溫組降低更明顯(P均<0.01)。常溫組、亞低溫組、高壓氧組、聯(lián)合組神經(jīng)干細胞細胞內(nèi)Ca2+濃度分別為(286.6±34.7)、(236.6±21.4)、(234.6±19.0)、(202.6±15.0)nmol/L，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。常溫組、亞低溫組、高壓氧組、聯(lián)合組神經(jīng)干細胞凋亡率分別為(24.76±0.16) % 、(19.13±0.84)%、(18.13±0.76)%、(10.13±0.26)%，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 亞低溫治療能通過影響RhoA/RHOCK通路發(fā)揮調(diào)控神經(jīng)干細胞凋亡、增殖、分化的作用。

脊髓損傷；亞低溫； 高壓氧；神經(jīng)干細胞；RhoA/ROCK通路；大鼠

脊髓損傷后神經(jīng)不能再生、修復(fù)，是導(dǎo)致患者致殘、致死率增高的根本原因。RhoA/RHOCK通路是調(diào)節(jié)脊髓損傷后神經(jīng)軸突再生的重要信號通路，與神經(jīng)干細胞的增殖、分化密切相關(guān)[1]。大量臨床研究證明，亞低溫能有效減輕繼發(fā)性腦和脊髓損傷，對中樞神經(jīng)損傷有確切的保護作用；同時亞低溫改善脊髓損傷區(qū)域的微環(huán)境，有利于移植細胞的增殖、活化、生長[2～4]。2015年1～6月，我們采用亞低溫聯(lián)合高壓氧干預(yù)大鼠損傷造模神經(jīng)干細胞，檢測RhoA/RHOCK通路表達情況，探討亞低溫聯(lián)合高壓氧對神經(jīng)干細胞凋亡、增殖、分化的作用。

1　材料與方法

1.1神經(jīng)干細胞培養(yǎng)、鑒定 取孕14～16 d的Wistar大鼠1只，引頸處死，75%乙醇浸泡消毒。打開鼠腹取出胎鼠，將胎鼠大腦浸泡在DMEM/F12液中，去除腦膜和血管，用吸管反復(fù)吹打成懸液，過100目孔篩網(wǎng)。過濾懸液接種于培養(yǎng)瓶中，于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在原代培養(yǎng)到第3天時，對培養(yǎng)細胞進行Nestin免疫熒光染色鑒定，完成PKH2染色標記過程。苔盼藍試驗檢測存活率﹥90%，提示標記后細胞存活。免疫熒光染色顯示神經(jīng)干細胞球呈Nestin強陽性表達。

1.2神經(jīng)干細胞損傷模型制備及分組自行設(shè)計液壓沖擊裝置，該裝置由壓力表、50 mL注射器、三通管、擺錘(4.8 kg)、打擊架、培養(yǎng)瓶組成。將原代培養(yǎng)神經(jīng)干細胞培養(yǎng)瓶中充滿培養(yǎng)液，通過三通管連接于液壓裝置中的壓力表和注射器(內(nèi)含25 mL培養(yǎng)液)的一端。擺錘連接于打擊架上，從一定高度落下，打擊注射器的另一端活塞，其產(chǎn)生的壓力經(jīng)注射器液體傳遞至培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)細胞層，對細胞造成損傷，沖擊壓力3.0 kP，作用時間20～30 s。制備大鼠神經(jīng)干細胞液壓損傷模型隨機分為常溫組、亞低溫干預(yù)組、高壓氧組、聯(lián)合組4組，每組設(shè)6個樣本。常溫組神經(jīng)干細胞常溫放置；亞低溫干預(yù)組神經(jīng)干細胞于損傷后1 h進行亞低溫干預(yù)4 h，溫度為(32±0.5)℃；高壓氧組予以高壓氧干預(yù)；聯(lián)合組亞低溫干預(yù)同時予以高壓氧干預(yù)。

1.3神經(jīng)干細胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR基因及蛋白表達檢測亞低溫干預(yù)4 h后將各組神經(jīng)干細胞在玻璃蓋片上用甲醇在-20 ℃固定10 min，然后用兔抗大鼠RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR抗體(1∶200) 4 ℃孵育16 h；PBS溶液沖洗30 min，F(xiàn)ITC標記的山羊抗兔IgG抗體(1∶1 000)室溫孵育1 h，再用PBS溶液沖洗30 min。神經(jīng)干細胞造模后72 h，采用免疫熒光檢測神經(jīng)干細胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR基因及蛋白表達。

1.4神經(jīng)干細胞內(nèi)Ca2+濃度測定亞低溫干預(yù)4 h后，在蓋玻片上培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞經(jīng)PBS沖洗3次，于37 ℃條件下用終濃度為10 μmol/L的Fluo-3/AM(美國Bio-Rad公司)負載45 min。蓋玻片倒置密封小室上，用Insight-Plus IQ型激光共聚焦顯微鏡(美國Meridian公司)以488 nm氫激光激發(fā)而產(chǎn)生熒光，測定其熒光強度。根據(jù)熒光強度值計算神經(jīng)干細胞內(nèi)Ca2+濃度。

1.5神經(jīng)干細胞凋亡率檢測亞低溫干預(yù)4 h后，采用TUNEL法檢測神經(jīng)干細胞凋亡，主要過程按試劑盒說明書進行。用DAB顯色，顯微鏡下觀察，細胞核被染呈棕色或棕褐色為陽性，即凋亡細胞。隨機選5個視野，400倍光鏡下計數(shù)凋亡細胞，計算凋亡率。

2　結(jié)果

2.1各組神經(jīng)干細胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR mRNA表達見表1。

表1　　　　各組RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR mRNA表達比較

注：與常溫組比較，△P<0.05，#P<0.01。

2.2各組神經(jīng)干細胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR蛋白表達見表2。

表2　各組RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR 蛋白表達比較

注：與常溫組比較，△P<0.05，#P<0.01。

2.3各組神經(jīng)干細胞內(nèi)鈣離子濃度神經(jīng)干細胞內(nèi)鈣離子濃度常溫組、亞低溫組、高壓氧組、聯(lián)合組分別為(286.6±34.7)、(236.6±21.4)、(234.6±19.0)、(202.6±15.0)nmol/L，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

2.4各組神經(jīng)干細胞凋亡率常溫組、亞低溫組、高壓氧組、聯(lián)合組神經(jīng)干細胞凋亡率分別為(24.76±0.16)%、(19.13±0.84)%、(18.13±0.76)、(10.13±0.26)%，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

3　 討論

脊髓損傷后神經(jīng)不能再生、修復(fù)是導(dǎo)致患者致殘及病死率增高的根本原因。神經(jīng)干細胞具有自我增殖能力以及多向分化的潛能,在一定條件下可以分化成神經(jīng)系統(tǒng)中的各種細胞,因此在神經(jīng)損傷修復(fù)方面有著良好的應(yīng)用前景。研究表明神經(jīng)干細胞分化、增殖不局限于其來源區(qū)域，具有很強的可塑性。神經(jīng)干細胞的分化主要受基因調(diào)控，基因表達方式受其自身固有分子程序的調(diào)控和周圍微環(huán)境的影響[5～7]。

大鼠脊髓損傷后，脊髓損傷區(qū)產(chǎn)生的軸突抑制因子，通過對RhoA的調(diào)控，導(dǎo)致RhoA/RHOCK通路異常，神經(jīng)干細胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR mRNA、蛋白表達增強，引起RhoA/RHOCK通路激活、信息傳導(dǎo)抑制等一系列反應(yīng)，最終使脊髓神經(jīng)組織生長錐塌陷，抑制軸突再生[8，9]。RhoA/RHOCK信號通路傳導(dǎo)過程中，RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR蛋白能提高神經(jīng)干細胞內(nèi)Ca2+濃度；Ca2+超載時可激活多種蛋白水解酶，其中鈣依賴性中性蛋白酶是一重要的蛋白水解酶，其所作用的底物為細胞骨架蛋白。微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)是細胞骨架中微管的重要組成成分之一，它可促進微絲聚合成微管，提高微管的穩(wěn)定性。亞低溫聯(lián)合高壓氧能降低神經(jīng)干細胞內(nèi)RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR蛋白表達，抑制神經(jīng)干細胞內(nèi)Ca2+超載，阻斷蛋白水解酶的激活，保護MAP-2正常表達，維持細胞骨架結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，促進神經(jīng)細胞存活、增殖。亞低溫聯(lián)合高壓氧能抑制脊髓損傷后炎性因子的釋放，抑制脊髓損傷區(qū)凋亡基因、軸突生長抑制相關(guān)基因的表達，對RhoA/RHOCK通路激活環(huán)節(jié)產(chǎn)生完全阻斷或部分阻斷作用，封閉細胞內(nèi)抑制信號的傳導(dǎo)。

大量臨床研究證明，亞低溫能有效減輕繼發(fā)性腦和脊髓損傷，對脊髓損傷有確切的保護作用；同時亞低溫能改善脊髓損傷區(qū)域的微環(huán)境，有利于移植細胞的增殖、活化、生長[10～12]。本研究采用亞低溫聯(lián)合高壓氧干預(yù)大鼠損傷造模神經(jīng)干細胞，檢測RhoA/RHOCK通路表達情況、神經(jīng)干細胞內(nèi)Ca2+濃度及神經(jīng)干細胞凋亡情況，顯示聯(lián)合組、高壓氧組、亞低溫組神經(jīng)干細胞RhoA、RHOCK、Nogo-A、NgR基因及蛋白表達較常溫組明顯降低，聯(lián)合組比高壓氧組、亞低溫組降低更明顯。聯(lián)合組、亞低溫組和高壓氧組的神經(jīng)干細胞內(nèi)Ca2+濃度低于常溫組，聯(lián)合組較亞低溫組和高壓氧組神經(jīng)干細胞內(nèi)Ca2+濃度降低明顯。表明亞低溫及高壓氧都能降低神經(jīng)干細胞內(nèi)Ca2+濃度，兩者聯(lián)合具有協(xié)同作用。聯(lián)合組神經(jīng)干細胞凋亡率低于高壓氧組和亞低溫組，說明亞低溫和高壓氧均能夠減輕損傷神經(jīng)干細胞的凋亡，兩者聯(lián)合作用更明顯。

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