心抑瘤素M及其受體在壓力負(fù)荷致心肌肥厚小鼠心肌組織中的表達(dá)及意義

沈滌非，袁園，吳青青，鄧偉，倪健，唐其柱

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院·武漢大學(xué)心血管病研究所·心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430060)

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心抑瘤素M及其受體在壓力負(fù)荷致心肌肥厚小鼠心肌組織中的表達(dá)及意義

沈滌非，袁園，吳青青，鄧偉，倪健，唐其柱

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院·武漢大學(xué)心血管病研究所·心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430060)

目的探討心抑瘤素M(OSM)/ OSM受體(OSMR)在壓力負(fù)荷致心肌肥厚小鼠心肌組織中的表達(dá)及其意義。方法 選擇野生型C57BL/6J小鼠60只，隨機(jī)分成為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(AB組)各30只，AB組采用胸主動脈縮窄術(shù)建立心肌肥厚模型。兩組于術(shù)后4周行超聲檢測心功能，處死后觀察心臟大體觀并行心肌組織病理學(xué)檢測。應(yīng)用RT-PCR檢測小鼠心肌組織OSM、IL-31、OSMR mRNA表達(dá)，應(yīng)用Western blotting檢小鼠心肌組織測OSM、IL-31、OSMR亞單位(OSMRβ)蛋白表達(dá)。結(jié)果 術(shù)后4周，大體觀察顯示AB組小鼠心臟體積增大，心腔擴(kuò)大，病理染色顯示心肌細(xì)胞橫截面積增加。與Sham組相比，AB組舒張期室間隔厚度、左室舒張末內(nèi)徑和左室收縮末內(nèi)徑增大，射血分?jǐn)?shù)及短軸縮短率減小(P均<0.05)；AB組心肌OSM mRNA、OSM蛋白、OSMR mRNA、OSMRβ蛋白表達(dá)均較Sham組明顯上調(diào)(P<0.05或<0.01)。結(jié)論 壓力負(fù)荷致心肌肥厚模型小鼠心肌組織中OSM及其OSMRβ均發(fā)生異常表達(dá)， OSM/OSMRβ系統(tǒng)參與了心肌重構(gòu)導(dǎo)致心肌肥厚的過程。

心肌肥厚；心抑瘤素M；心抑瘤素M受體亞單位；壓力負(fù)荷；IL-31;小鼠

心肌肥厚是心臟為了適應(yīng)增加的血流動力學(xué)需求而產(chǎn)生的一種代償機(jī)制，是高血壓、心肌梗死、瓣膜病等多種心血管疾病的共同病理生理過程。在器官水平表現(xiàn)為心臟尤其是左心室肥大、室壁增厚、室壁韌性下降，細(xì)胞水平表現(xiàn)為心肌細(xì)胞增大、間質(zhì)細(xì)胞增殖并產(chǎn)生大量膠原沉積使纖維組織增多。這些變化的不斷積累使心肌順應(yīng)性和心功能下降，最終心臟的泵血功能無法滿足機(jī)體需要而發(fā)生心力衰竭。目前，尚無心抑瘤素M(OSM)/ OSM受體(OSMR)亞單位(OSMRβ)在心肌肥厚中的相關(guān)研究報道。2015年3月～2016年3月，我們對此進(jìn)行了研究。

1　材料與方法

1.1動物及分組野生型C57BL/6J雄性小鼠60只，8周齡，體質(zhì)量24～27g。隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(AB組)各30只。

1.2心肌肥厚動物模型建立AB組采用胸主動脈縮窄建立小鼠心肌肥厚模型。經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉小鼠，沿第2～3肋間水平切開皮膚，依次分離肌肉及軟組織，游離胸主動脈，將7-0手術(shù)縫線穿過主動脈，將去尖的27號針頭連同主動脈一起結(jié)扎，然后立即抽出針頭，造成主動脈70% 狹窄后，逐層縫合切口。術(shù)后4周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。假手術(shù)組只在分離主動脈后穿過一條短絲線，不作結(jié)扎，其他手術(shù)步驟同AB組。

1.3超聲檢測心功能術(shù)后4周，異氟烷吸入性麻醉小鼠，將小鼠左胸前區(qū)剃毛，涂抹耦合劑，取左側(cè)臥位或仰臥位對小鼠行超聲檢查。選取標(biāo)準(zhǔn)左心室乳頭肌短軸切面，測量小鼠左室收縮末內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、舒張期室間隔厚度(IVSD)、左心室后壁厚度(LVPWD)、射血分?jǐn)?shù)(EF)以及短軸縮短率(FS)。采用設(shè)備為高頻超聲診斷儀, 頻率為15 MHz。

1.4心肌組織病理學(xué)檢查超聲檢測后處死小鼠，取出小鼠心臟，用濾紙吸干血液后肉眼觀察心臟大體觀。每組都各取10個心臟加入10倍量 4%多聚甲醛固定后24 h后將小鼠心臟放于翻拍板上用照相機(jī)(尼康D700)拍大體心臟。將拍完后的心臟脫水、石蠟包埋、切片厚度4 μm, 每個心臟各切18張)。切片進(jìn)行常規(guī)HE染色和FITC標(biāo)記的麥胚芽凝集素染色。

1.5心肌組織OSM、IL-31、OSMR mRNA 表達(dá)檢測采用RT-PCR法。使用TRIzol提取心肌組織中的總RNA，分光光度計(jì)測量A260、A280，以A230/A260比值計(jì)算RNA的提取量和純度。使用寡脫氧核糖核苷酸引物和PCR儀將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用LightCycler 480 SYBR?Green 1 Master Mix體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：5 min 95 ℃變性，之后開始42次引物擴(kuò)增循環(huán)。PCR結(jié)果使用雙重標(biāo)準(zhǔn)化曲線來量化，使用GAPDH mRNA表達(dá)進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.6心肌組織OSM、IL-31、OSMRβ蛋白表達(dá)檢測采用Western blotting法。將心肌組織勻漿溶于裂解緩沖液中，采用BCA法測量蛋白濃度。將組織裂解產(chǎn)物使用10%SDS-PAGE膠進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再使用5%脫脂牛奶封閉2 h。孵育一抗4 ℃過夜。37 ℃孵育二抗1 h，使用雙色紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行掃膜分析。

2　結(jié)果

2.1兩組心臟組織及超聲檢查各項(xiàng)指標(biāo)比較術(shù)后4周，AB模型組小鼠大體觀察顯示心臟體積增大，心腔擴(kuò)大；病理染色顯示心肌細(xì)胞橫截面積增加。與Sham組相比，AB模型組小鼠超聲檢查IVSD、LVEDD和LVESD增大(P均<0.05)，EF 和FS 減小(P均<0.05)。見表1。

表1　兩組心臟超聲檢查各項(xiàng)指標(biāo)比較±s)

注：與Sham組比較,*P<0.05。

2.2兩組心肌組織OSM、IL-31、OSMR、OSMRβ的表達(dá)與Sham組相比，術(shù)后4周AB組心肌OSM mRNA、OSMR mRNA表達(dá)升高(P均<0.01)，OSM蛋白、OSMRβ蛋白表達(dá)上調(diào)(P均<0.05)；而IL-31mRNA和蛋白表達(dá)無明顯變化。見圖2、圖3。

注：與Sham組比較，*P<0.05，#P<0.01。

圖1 OSM、IL-31和OSMR mRNA在心肌組織的表達(dá)

注：與Sham組比較，*P<0.05，#P<0.01。

圖2OSM、IL-31和OSMRβ 蛋白在心肌組織的表達(dá)

3　討論

OSM最早是從U937組織型瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清中分離出的一種對A375黑色素瘤細(xì)胞生長有抑制作用的細(xì)胞因子，主要由活化的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生，在骨髓、脾臟等組織也有表達(dá)，但在肝臟、肺、卵巢、小腸、腎臟以及腦組織檢測不到其表達(dá)[1]。OSM、IL-6、IL-11和白血病抑制因子(LIF)以及IL-31等細(xì)胞因子都屬于IL-6或糖蛋白130(gp130)細(xì)胞因子家族，該家族成員的生物活性具有多樣化的特點(diǎn)，在細(xì)胞分化增殖、血細(xì)胞生成、免疫調(diào)節(jié)、炎癥應(yīng)答和協(xié)調(diào)細(xì)胞因子功能等方面發(fā)揮著廣泛而重要的作用[2]。該家族細(xì)胞因子通過結(jié)合gp130二聚體或gp130與其他受體蛋白形成的異二聚體受體激活其下游信號通路，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[3,4]。

OSMR有兩型，其中OSMⅡ型受體是由OSMR基因編碼的OSMRβ蛋白和gp130組成的異二聚體受體。同時，OSMRβ和IL-31RA組成的異二聚體也構(gòu)成了IL-6細(xì)胞因子家族另一成員，即IL-31受體復(fù)合物。OSMRβ 表達(dá)范圍廣泛，幾乎分布于人體所有的器官和組織，在不同的器官和組織，以及同一器官或組織的不同類型細(xì)胞間表達(dá)存在差異[5]。IL-6細(xì)胞因子家族成員LIF在心肌肥厚的心臟表達(dá)增高，通過LIFRβ和gp130形成的異二聚體受體激活ERK1/2信號途徑導(dǎo)致Th細(xì)胞水平下降[6]。同時，生長相關(guān)蛋白43、Collapsin反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白以及多唾液酸神經(jīng)細(xì)胞黏附分子等幼稚神經(jīng)元標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)。而且升高的LIF和心肌營養(yǎng)素-1通過gp130信號通路上調(diào)副交感神經(jīng)標(biāo)志物如膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶和膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá), 引起交感神經(jīng)向膽堿能神經(jīng)轉(zhuǎn)移分化[7]。

本研究成功建立了壓力負(fù)荷致心肌肥厚小鼠模型。術(shù)后4周，IL-31主要由活化的CD4+T淋巴細(xì)胞(尤其是Th2輔助T淋巴細(xì)胞)、主細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生，其主要作用于皮膚、肺、腸道組織以及神經(jīng)系統(tǒng)。目前的研究提示，IL-31主要與過敏性疾病發(fā)生相關(guān)[8,9]。本研究AB組IL-31在心肌組織mRNA及蛋白與Sham組無明顯差異，提示IL-31可能未參與AB組小鼠心肌重構(gòu)的過程。而OSMR/OSMRβ在AB組小鼠心肌組織表達(dá)顯著增加，說明OSM/OSMR信號系統(tǒng)在心肌肥厚小鼠心肌重構(gòu)過程中被激活，且可能在這一過程中起到重要作用。

目前，OSM/OSMRβ信號途徑在心血管疾病相關(guān)研究較少，其在心臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中的作用還存在爭議[10]。OSMR基因缺陷小鼠在正常飲食情況下于16周出現(xiàn)胰島素抵抗，32周出現(xiàn)肥胖、嚴(yán)重的肝脂肪變性和胰島素抵抗[11]，說明OSMR基因可能與組織代謝調(diào)節(jié)相關(guān)。對于缺血性心臟病，OSM/OSMRβ信號系統(tǒng)具有心臟保護(hù)作用。在缺血/再灌注的糖尿病小鼠模型中，該系統(tǒng)激活可減少心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)線粒體的生物合成，增強(qiáng)心肌胰島素敏感性[12]。另外，OSM/OSMRβ信號激活可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞去分化，并使心肌細(xì)胞分泌巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子Reg3β增加。巨噬細(xì)胞在受損的心臟組織聚集，可移除中性粒細(xì)胞，減少組織降解，在心肌梗死早期促進(jìn)心肌修復(fù)和重構(gòu)，保護(hù)應(yīng)激狀態(tài)下的心功能[13, 14]。而對于擴(kuò)張型心肌病而言，抑制OSM信號途徑的激活，可抑制擴(kuò)張型心肌病小鼠模型心肌重構(gòu)，改善擴(kuò)張型心肌病小鼠心功能。說明OSM信號途徑的持續(xù)激活，對心臟結(jié)構(gòu)和功能的長期穩(wěn)定不利[14,15]。

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唐其柱(E-mai:qztang@whu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.33.010

R542.2

A

1002-266X(2016)33-0031-03

2016-06-27)