siRNA抑制X連鎖凋亡抑制蛋白基因對人HeLa細胞凋亡及周期的影響

唐薇薇，鄭 洪，厲國慧，王琳琳

(1 遵義醫學院，貴州遵義 563003；2 遵義醫學院附屬醫院)

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siRNA抑制X連鎖凋亡抑制蛋白基因對人HeLa細胞凋亡及周期的影響

唐薇薇1，鄭 洪2，厲國慧1，王琳琳1

(1 遵義醫學院，貴州遵義 563003；2 遵義醫學院附屬醫院)

目的探討特異性siRNA對宮頸癌Hela細胞X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)基因的抑制作用及其抑制后細胞凋亡和細胞周期的變化。方法 設計合成XIAP特異性抑制siRNA,并將Hela細胞分成4組，即觀察組(pGPU6/GFP/ Neo/ XIAP -siRNA轉染細胞)、空白組(未加siRNA及轉染試劑)、NC組(陰性對照，為所選目的序列被無序打亂的siRNA轉染)、Mock 組 (轉染試劑對照，加轉染試劑未加siRNA)。RT-PCR法檢測各組XIAP mRNA表達情況，流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況及細胞周期變化。結果 轉染48、72 h，觀察組XIAP mRNA表達分別為20.20±0.10、19.99±0.14，空白組分別為21.43±0.04、20.95±0.15，兩組比較均有統計學差異(P均<0.05)。轉染48 h，觀察組、空白組細胞凋亡率分別為(28.91±0.12)%、(9.73±0.02)%；轉染72h，觀察組、空白組細胞凋亡率分別為(37.29±0.10)%、(10.62±0.04)%；觀察組細胞凋亡率均高于空白組(P均<0.05)。空白組、Mock組、NC組間XIAP mRNA表達、細胞凋亡率比較均無統計學差異(P均>0.05)。與空白組相比, 觀察組轉染48、72 h后G0～G1期細胞增多而S期細胞減少(P均<0.05)。結論 特異性XIAP-siRNA可有效沉默宮頸癌Hela細胞XIAP基因，抑制細胞增殖并促進細胞凋亡。

宮頸腫瘤；Hela細胞；X連鎖凋亡抑制蛋白；微小干擾iRNA

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，其發病率和病死率呈逐年增高的趨勢。目前對宮頸癌的治療大多采用傳統的手術、放療或化療等手段，常常在殺死腫瘤細胞的同時，對正常的組織細胞也產生了不同程度的損傷。因此，如果能針對腫瘤細胞的特異性靶點治療，既能有效殺死腫瘤細胞，又能避免損傷正常細胞。X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)是凋亡抑制蛋白家族的重要成員，在宮頸癌細胞中高表達[1]，其可直接結合和抑制caspases進行多途徑調節細胞凋亡[2,3]。2006年6月，我們運用RNA干擾技術，將針對XIAP基因的特異性微小干擾RNA(siRNA)轉染宮頸癌Hela細胞，觀察其對細胞凋亡、基因表達及細胞周期的影響，以便為宮頸癌的特異性靶向治療提供依據。

1　材料與方法

1.1細胞及試劑宮頸癌HeLa細胞株購自ATCC；pGPU6/GFP/Neo 購自上海吉凱化學公司；質粒小提中量試劑盒購自Tiangen公司；新生小牛血清(NBS)購自杭州四季青生物公司；RT-PCR反應試劑盒購自Tiangen公司；PCR引物由上海捷瑞生物公司合成；流式試劑盒購自Invitrogen公司；LipofectamineTM2000購自Nvitrogen公司。

1.2pGPU6/GFP/Neo/XIAP-siRNA 構建與鑒定根據shRNA 的設計原則,從GenBank 中XIAP mRNA (NM001167) 上找到符合特征的靶序列。互補的寡核苷酸鏈在退火緩沖液作用下,經處理得到shRNA模板鏈以用于連接反應。再取pGPU6/GFP/Neo質粒載體行酶切處理, 進行載體連接反應。在每個連接反應中隨機挑選5個菌落，將其接種于含50μg/mL Kanamycin的LB培養基中。用堿裂解法抽提質粒，并用BamH I、Pst I分別進行酶切鑒定。

1.3細胞培養轉染及分組將宮頸癌細胞HeLa株培養于含10%NBS的RPMI1640培養基，取對數生長期細胞接種于6孔板中，5×105/孔，至細胞密度達70%進行轉染。操作步驟按LipofectamineTM2000說明書進行。將Hela細胞隨機分成4組并進行相應處理，即觀察組(pGPU6/GFP/ Neo/ XIAP -siRNA轉染)、空白組(未加siRNA及轉染試劑)、NC組(陰性對照，為所選目的序列被無序打亂的siRNA轉染)、Mock 組 (轉染試劑對照，加轉染試劑未加siRNA)。

1.4 XIAP mRNA表達檢測轉染48、72 h，各組細胞提取總RNA，按Trizol Reagent 總RNA提取試劑盒方法操作，進行熒光定量PCR反應。每組均重復3次，取平均Ct值。以空白組作為對照，按2-ΔΔCt法分析轉染后XIAP mRNA的表達情況。2-ΔΔCt值為轉染后XIAP mRNA表達量較空白組XIAP mRNA表達量的倍數，XIAP mRNA干擾效率=(空白組2-ΔΔCt-觀察組2-ΔΔCt)/空白組2-ΔΔCt×100%。

1.5細胞凋亡檢測轉染48、72 h，收集各組細胞，制備細胞懸液，預冷PBS洗滌2次；重懸于4×Binding Buffer, 使細胞密度為1×106/mL；采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.6細胞周期變化情況檢測轉染48、72 h，細胞重懸于4 ℃含30 g/L 牛血清白蛋白的乙醇中, 4 ℃固定24 h，離心,棄上清。預冷 PBS洗細胞2次，離心，棄上清。加50 mg/L的RNase 1 mL,室溫避光30 min，離心，棄上清。加入60 mg/L的PE 1 mL,室溫避光30 min，流式細胞儀檢測細胞周期中各期細胞構成情況。

2　結果

2.1pGPU6/GFP/Neo/XIAP-siRNA 重組質粒鑒定及細胞轉染情況合成編碼siRNA 模板鏈DNA，與線性化pGPU6/GFP/Neo 在T4 DNA 連接酶作用下連接，轉化感受態細胞TOP10，篩選陽性質粒，提取DNA，顯示酶切結果和測序結果與設計序列完全一致。空載體pGPU6/GFP共有5 117 bp，BamHⅠ位于1 663 bp，BbsⅠ位于1 720 bp，PstⅠ位于1 679 bp；陽性重組載體可以被BamHⅠ和BbsⅠ切開，而不能被PstⅠ切開。帶有綠色熒光蛋白的pGPU6/GFP/Neo/XIAP-siRNA質粒轉染細胞后，熒光顯微鏡觀察到70%～80%的細胞顯示綠色熒光。

2.2各組XIAP mRNA表達及XIAP mRNA干擾效率轉染48、72 h，觀察組與空白組XIAP mRNA表達比較有統計學差異(P均<0.05)，空白組、Mock組和NC組比較無統計學差異(P均>0.05)。見表1。觀察組轉染48 h和72 h，HeLa細胞中XIAP mRNA的干擾效率分別為27%、59%。

表1　各組轉染后XIAP mRNA表達比較

2.3各組細胞凋亡情況轉染48 h，觀察組、空白組、Mock組、NC組細胞凋亡率分別為(28.91±0.12)%、(9.73±0.02)%、(12.61±0.05)%、(10.90±0.08)%；轉染72 h，觀察組、空白組、Mock組、NC組細胞凋亡率分別為(37.29±0.10)%、(10.62±0.04)%、(12.93±0.07)%、(12.35±0.10)%。轉染48 h和72 h，觀察組細胞凋亡率均高于空白組(P均<0.05)，空白組、NC組、Mock組細胞凋亡率比較無統計學差異(P均>0.05)。觀察組轉染48 h與轉染72 h的細胞凋亡率比較有統計學差異(P<0.05)。

2.4觀察組轉染不同時間各期細胞構成變化轉染48 h和72 h，觀察組G0～G1期細胞分別為(59.02±0.13)% 和(62.25±0.12)%， S期細胞分別為(38.08±0.09)%和(33.48±0.06)%。與空白組相比, 觀察組G0～G1期增加而S期減少(P均<0.05)。見圖1。

圖1　兩組轉染不同時間各期細胞構成情況

4　討論

RNA干擾是進化過程中高度保守、由雙鏈RNA(dsRNA)誘發、同源mRNA高效特異性降解的現象。將特異性siRNA遞送進入生物細胞內均可引發RNA干擾，進而抑制特定基因的表達。大量研究表明，RNA干擾可用于治療蛋白過度表達相關疾病和單基因疾病[4]。XIAP基因是凋亡抑制蛋白家族中作用最強的一個基因，其可通過如下機制抑制細胞調亡:①導致caspase功能受到直接抑制；②通過參與信號轉導途徑抑制細胞凋亡；③通過NF-κB途徑抑制細胞調亡；④通過死亡受體通路介導引起細胞凋亡；⑤影響p53的功能[5]。

La Casse等[6]運用針對XIAP的反義寡核苷酸特異性下凋XIAP表達,可誘導腫瘤細胞凋亡。Wang等[7]研究表明，通過抑制XIAP可有效促進卵巢癌細胞凋亡。本研究以pGPU6/GFP/Neo熒光質粒為載體構建靶向XIAP siRNA真核表達質粒載體，針對腫瘤特定基因的位點引發干涉作用，從而更為有效地抑制目的基因的表達。本研究顯示，將特異性熒光質粒pGPU6/GFP/Neo/XIAP-siRNA成功轉染HeLa細胞后，可明顯抑制XIAP mRNA表達；從干擾效率來看，靶向siRNA-XIAP對HeLa細胞的XIAP基因抑制效果具有特異性和高效性；導入重組質粒后，也誘導和促進了HeLa細胞凋亡，隨轉染時間的延長，其凋亡率呈增高趨勢。同時，轉染后細胞周期發生變化，進入G0～G1期細胞明顯增多,S期細胞明顯減少。這可能是因為轉染后HeLa細胞增殖信號受到抑制，細胞周期進展受阻，細胞的增殖能力降低，導致細胞周期出現G0～G1期阻滯和細胞增殖抑制、S期表達下降，從而促進細胞凋亡進程。以上結果證實，XIAP表達下調可抑制宮頸癌HeLa細胞增值并促進其凋亡。

腫瘤的發生是細胞增殖與凋亡失衡的結果，特異性靶向治療是提高治療效果的一個重要途徑。隨著siRNA技術的不斷發展，多靶點聯合治療在促進腫瘤細胞凋亡以及提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性中都發揮了重要作用，具有廣闊的應用前景[8～10]。

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[4] Wittrup A, Lieberman J. Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics [J].Nat Rev Genet, 2015，16(9)：543-552.

[5] 張亞雷,張世能.凋亡抑制蛋白XIAP與消化系腫瘤關系的研究進展[J].國際內科學雜志，2007，34(11):657-659.

[6] La Casse EC，Cherton-Horvat GG, Hewitt KE, et al. Preclinical Characterization of AEG35156/ GEM 640,a second-generation antisense oligonucleotide targeting X-linked inhibitor of apoptosis [J]. Clin Cancer Res, 2006，12(17):5231-5241.

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XIAP gene inhibited by siRNA and its effect on apoptosis and cell cycle of HeLa cells

TANGWeiwei1,ZHENGHong,LIGuohui,WANGlinlin

(1ZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China)

ObjectiveTo explore the inhibitory effect of small interfering RNA(siRNA) silencing human X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) gene on cell cycle and apoptosis of cervical HeLa cells.MethodsDNA template coding XIAP specific siRNA was designed and synthesized. The Hela cells were divided into 4 groups: the observation group (pGPU6/GFP/Neo/XIAP-siRNA-transfected cells), blank group (not added with siRNA and transfection reagent), negative control group (NC group, transfected by disrupted siRNA) and transfection reagent control group (Mock group, added with transfection reagents and without siRNA). The XIAP-siRNA was transfected into HeLa cells. The expression level of XIAP mRNA was assayed by RT-PCR. The apoptosis rate and cell cycle distribution were analyzed by flow cytometry.ResultsSignificant difference was found in the expression of XIAP mRNA at 48 and 72 h after transfection between the observation group and blank group (allP<0.05), but no significant difference was found among the blank group, Mock group and NC group (allP>0.05). In the observation group, the interference rates of HeLa cells transfected with XIAP-siRNA at 48 and 72 h were 27% and 59%. The apoptotic rate of the observation group was higher than that of the blank group (allP<0.05). Significant difference was found in the apoptosis rate of the observation group between the transfection of 48 h and 72 h (P<0.05). Compared with the blank group, the cells in the G0-G1phrase increased and then decreased in the S phrase at 48 and 72 h after transfection (allP<0.05).CondnsionSpecific XIAP-siRNA can effectively silence the XIAP gene of cervical cancer Hela cells, inhibit the proliferation and promote the apoptosis.

cervical neoplasms; Hela cells; X-linked inhibitor of apoptosis protein; small interfering RNA

貴州省科技廳基金資助項目(黔科合J字[2007]2128號)。

唐薇薇(1980-)，女，講師，醫學碩士，研究方向為腫瘤分子病理學。E-mail：wo19701110@163.com

簡介：鄭洪(1962-)，男，教授，博士，研究方向為腫瘤分子病理學。獲貴州省科技進步三等獎2項、遵義市科學技術進步二、三等獎各1項。E-mail：zhenghonghq@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.33.007

R737.3

A

1002-266X(2016)33-0022-03

2016-05-09)