基于線粒體控制區部分序列的南海大斑石鱸遺傳多樣性分析

郜星晨, 章 群, 薛 丹, 宮亞運, 曹 艷, 韓博平

?

基于線粒體控制區部分序列的南海大斑石鱸遺傳多樣性分析

郜星晨1, 2, 章 群1, 薛 丹1, 宮亞運1, 曹 艷1, 韓博平1

(1. 暨南大學生態系, 熱帶亞熱帶水生態工程教育部工程研究中心, 廣州 510632; 2. 中國長江三峽集團公司中華鱘研究所, 湖北宜昌443100)

為了研究南海大斑石鱸()不同地理群體的遺傳多樣性情況, 作者測定了東興、烏石、潭門、閘坡4個群體共計61尾大斑石鱸控制區的993 bp序列。檢測出變異位點35個, 單倍型47種, 平均單倍型多樣性指數為0.9884, 核苷酸多樣性指數為0.0076, 總體表現出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特點, 其中潭門群體核苷酸多樣性相對較高(0.00879)。中性檢驗結果顯示Fu’s Fs值均為顯著負值–5.34(=0.03), 核苷酸不配對分布沒有顯著偏離群體擴張模型呈現出單峰(SSD值和Rg指數較小), 表明大斑石鱸在歷史上經歷過種群擴張, 推測擴張時間約4.74萬~1.18萬年間。群體間(0.0065~0.0089)與群體內遺傳距離(0.0066~0.0089)處于同一水平, 總遺傳分化指數Fst為–0.0057 (>0.05), 群體間基因流Nm=33.76。不同組群劃分方式的分子方差分析均表明群體內遺傳差異顯著大于群體間, 遺傳變異主要來源于群體內部。南海海域大斑石鱸群體遺傳多樣性匱乏, 群體間不存在顯著的遺傳分化, 可劃歸一個管理保護單元, 潭門群體建議優先給予保護。

大斑石鱸(); 控制區; 遺傳多樣性

大斑石鱸()隸屬鱸形目(Perciformes)、石鱸科(Pomadasyidae)、石鱸屬(), 俗名猴鱸、海猴, 廣泛分布于印度洋和太平洋西部, 在中國分布于南海和東海近海, 主要漁場為北部灣沿岸及潿洲島附近。大斑石鱸為暖水性中下層中小型魚類, 肉質鮮美, 生長較快, 有一定經濟價值[1]。近年來由于北部灣海區一直處于過度捕撈狀態, 魚類資源持續衰退, 自然海區大斑石鱸魚類數量減少, 分布區域也大為縮小[2]。目前大斑石鱸研究僅局限于形態、分類和分布, 分子遺傳學方面僅在石鱸科系統發育研究中有所涉及, 如朱世華[2]等探討了大斑石鱸及其他4種石鱸科魚類親緣關系; 梁日深[3]等基于S7核糖體蛋白基因序列分析了大斑石鱸在內11種石鱸屬魚類分子系統進化關系; 任崗[4]等選用16S rRNA基因研究石鱸科魚類種間關系, 尚未見到大斑石鱸遺傳多樣性及種質資源方面研究報道。

遺傳多樣性是生物進化和適應復雜環境的物質基礎, 是種質資源有效保護和合理利用的依據[5]。線粒體DNA(mtDNA)具有分子結構簡單, 嚴格的母系遺傳、無重組和進化速度快等優點, 是群體遺傳學研究的理想分子標記[2]。mtDNA中存在一個非編碼區, 即控制區, 是整個線粒體DNA序列中變異最大的區域, 能夠敏感的反應出海洋魚類的群體遺傳結構, 在魚類分類、系統發育、群體遺傳學等方面已有廣泛的應用[5]。本研究通過測定南海4個海域大斑石鱸mtDNA控制區序列, 探討其遺傳多樣性和遺傳分化情況, 分析其種群遺傳結構和歷史動態, 旨在促進大斑石鱸有效開發和可持續管理, 為種質資源的保護積累基礎材料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料、DNA提取與PCR擴增測序

2011年~2014年于廣東閘坡(ZP)、廣東烏石(WS)、海南潭門(TM)和廣西東興(DX)分別采集大斑石鱸(圖1), 測得叉長范圍9~22 cm, 體質量250~ 400 g。樣品用95%的酒精固定后保存, 采用高鹽法提取總基因組DNA[6]。采用自行設計的引物DL1 (5′-GTT GGA ATC CTC CCT ACT GCTC-3′), DL2 (5′-TCT TAA CCA CCC TTT ACG CCGA-3′)進行擴增, 擴增條件與檢測參照任崗等[4]的方法, PCR產物送至北京六和華大基因有限公司切膠純化并測序。

1.2 數據處理

使用MEGA 6軟件上對手工校對后的測定序列進行對位排列, 統計序列的堿基組成、變異位點、多態簡約信息位點、轉換或顛換比值等, 根據Kimura雙參數模型(Kimura 2-parameter, K2P), 計算遺傳距離。使用Dnasp 5.10計算群體的單倍型數、核苷酸酸多樣性(Pi)、單倍型多樣性(Hd), 分析群體間遺傳變異指數(), 1000次重復隨機抽樣重排后進行顯著性檢驗, 群體間的基因流值()=(1–)/(2), 通過分子方差(AMOVA)分析檢驗遺傳變異分布模式[7]。借助TCS 2.1構建單倍型簡約網絡圖, 分析單倍型分布情況。以Arlequin 3.5軟件進行Tajima’s D和Fu’s Fs中性檢驗分析, 并通過核苷酸不配對分布分析檢驗種群歷史動態; 采用廣義非線性最小方差估算擴張參數, 根據=2估算群體歷史擴張時間, 其中=2(為所研究的控制區基因的變異速率,表示片段長度),為自擴張以來經歷的代數[8]。

2 結果與分析

2.1 大斑石鱸的控制區基因序列特征

序列比對分析后獲得控制區前段序列993 bp, A、T、C、G組成的平均值分別是30.7%、29.0%、24.3%、16.0%。A+T平均含量59.6%, G+C平均含量40.4%, 表現出明顯的反G偏倚, 與脊椎動物線粒體DNA的特點一致。全部序列共有變異位點35個(占DNA核苷酸總數的3.5%), 簡約信息位點30個。轉換與顛換比例為17.6, 遠大于劉朋朋等[5]提出的期望值0.5, 表明此片段沒有飽和, 適合系統發育分析。大斑石鱸遺傳多樣性參數見表1。其中潭門群體核苷酸多態性指數最高, 烏石群體單倍型多樣性和核苷酸多態性均最低。

表1 不同群體大斑石鱸的遺傳多樣性參數

2.2 大斑石鱸的系統發育與遺傳分化

在以K2P模型構建的單倍型鄰接樹和單倍型TCS最大簡約網絡中(圖2)不同來源的單倍型散亂無序分布于各個分支, 不呈現地方群體為單位的家系式分支現象, 沒有明顯的地理結構和譜系結構[8]。47個單倍型中, 39個為獨享單倍型, 僅有4個單倍型為2個以上個體共享, 顯示大部分單倍型頻率較低。

群體間平均遺傳距離為0.0077(0.0065~0.0085), 群體內遺傳距離0.0066~0.0089, 二者處于同一水平。群體之間的遺傳變異指數值為–0.022~0.003, 總遺傳變異指數值為–0.0057, 均未表現出統計學顯著性。4個群體基因流值均大于4, 平均基因流值為33.76, 群體間存在較大基因流。通過設定兩種AMOVA分析檢測大斑石鱸的群體遺傳結構: (1)將南海4個群體劃分為一個組群以檢驗群體間是否存在顯著的遺傳結構; (2)按樣品的來源將4個群體劃分為2群組檢驗是否存在顯著地理結構: 將瓊州海峽東側潭門、閘坡為一地理區, 華南大陸沿海西部烏石、東興為另一地理區; 將瓊州海峽南部潭門為一地理區, 北部烏石、東興、閘坡為另一地理區[7]。兩種AMOVA分析顯示, 4個群體間(=0.659)及不同地理區劃分方式(=0.559)均不存在顯著的遺傳結構, 遺傳變異主要集中在群體內個體間(99.08%~100.65%), 只有–0.16%~ 0.01%發生在群體間。

2.3 種群歷史動態

Tajima’s D和Fu’s Fs檢驗結果表明(表2), 分別對4個地理群體及群體整體進行中性分析, 不同群體Tajima’s D多為負值, 整體Tajima’s D= –0.23 (>0.1), 統計學檢驗不顯著; 4個群體Fu’s Fs中性檢驗均為顯著性負值, 整體Fu’s Fs值為–5.34且顯著(=0.03), 明顯偏離中性突變。由于在相同條件下, Fu’s Fs檢驗對種群近期擴張事件比較敏感, 故可判斷大斑石鱸近期可能經歷了快速種群擴張[5]。南海大斑石鱸各個地理群體和整體核苷酸岐點分布呈單峰(圖3); 對核苷酸不配對的觀測分布和擴張模式下的預期分布一致性進行擬合優度檢驗顯示群體平均方差之和(SSD)和平滑性檢驗統計值(Raggedness)均較小, 統計檢驗均不顯著, 證實了所觀測的核苷酸錯配分布與群體擴張模式相符[8], 表明4個群體歷史上發生了不同程度的種群擴張。θ1/θ0表明有效群體大小在擴張前后發生很大變化[8], 也提示南海大斑石鱸發生快速擴張, 核苷酸不配對分析與中性進化檢驗結果基本一致。根據核苷酸錯配分析總的τ觀察值3.76, 以生殖周期為3 年計, (3%~10%)/百萬年的控制區分歧速率, 估算擴張時間約為4.74萬年~1.18萬年, 處于末次冰期期間。

表2 南海近海4個大斑石鱸群體的中性檢驗和錯配分布參數

注: *. 統計顯著水平(<0.05), **. 統計極顯著水平(<0.01)

3 討論

3.1 大斑石鱸的種群動態與遺傳多樣性

大斑石鱸總體表現出高Hd低Pi的特點, 中性檢驗Fu’s Fs為顯著負值, 核苷酸不配對分布為單峰, 表明在末次冰盛期后期(4.74萬年~1.18萬年)經歷了種群擴張。大斑石鱸為近岸繁殖的暖水性魚類, 棲息在20~110 m的底質海區[1]。在末次冰盛期南海海平面比現在低130~150 m[9], 隨著間冰期氣溫回升海平面不斷上升, 生存空間擴大到整個南海大陸架區, 大斑石鱸得以快速擴張。大斑石鱸繁殖周期長(可從1月長達4月份)、產卵場較集中(多在南海北部)等特點[1], 可能利于群體快速增長, 產生高的單倍型多樣性, 但尚缺乏足夠時間積累核苷酸序列的多樣化。類似的高Hd低Pi遺傳多樣性模式在同海域分布的軍曹魚()[9]、花鱸()[10]等魚類研究中也被檢測到。

群體mtDNA的Pi值是衡量遺傳多樣性的重要指標, Pi值越大表示群體mtDNA多態程度越高[9]。南海大斑石鱸Hd和Pi平均值分別為0.9884±0.0060和0.0076±0.0040, 核苷酸多樣性值較同海域分布魚類如紅鰭笛鯛()[11](Pi=0.031)、黃鰭鯛()[12](Pi=0.026)等低, 較石鱸科其他魚類如斜帶髭鯛()[13](Pi=0.022)、三線磯鱸()[14](Pi=0.0058)等也處于中等偏下水平。海洋魚類遺傳多樣性水平受多種因素如有效種群大小、群體擴張等影響, 也與自身棲息地環境相關。大斑石鱸經歷過近期種群擴張或“遺傳瓶頸”, 群體尚缺乏足夠時間在遷移和漂變之間取得平衡, 導致遺傳多樣性較為匱乏[9]。另外該海域環境污染、過度捕撈等人為因素也可能導致資源的衰退和有效種群的減少, 影響大斑石鱸遺傳多樣性水平。

3.2 大斑石鱸的遺傳分化

TCS網絡圖中不同來源個體混雜分布, 無明顯地理結構。基于樣品來源的地理格局, 假設華南沿海與海南島種群關系較遠, 但AMOVA分析顯示群體內個體的變異是變異的主要來源, 不同地理區群體間差異不顯著, 說明瓊州海峽并未起到有效的地理屏障作用。在缺少阻礙擴散的開放海洋環境里, 大斑石鱸的卵、幼體及成體都具有較強的遷移能力, 以致分化水平較低, 群體沒有地理結構和譜系結構[14]。遺傳分化也與生態習性及生活史密切相關, 大斑石鱸春季繁殖期會洄游向近岸或者河口, 洄游過程中不同群體間個體的混合可能導致群體間產生基因交流。此外, 南海沿海季風漂流、黑潮分支、南海暖流、南海冷水等海流的輸送作用加強了大斑石鱸卵和幼體的擴散, 也是遺傳分化程度較低的推動原因。

3.3 種質資源的保護

物種的生存適應能力、進化潛力與遺傳多樣性密切相關, 遺傳多樣性的降低可導致物種生存抵抗力與生殖力下降、物種退化等[13], 因此遺傳多樣性受到極大威脅的大斑石鱸野生群體應得到足夠保護。本研究4個南海地理群體無明顯的遺傳差異, 可劃歸同一個保護單元, 潭門群體野生資源較多, 遺傳多樣性水平相對較高, 建議優先加以保護。本研究涉及的地理群體量和種群數量有限, 同時控制區單一標記, 可能還不足以準確反映大斑石鱸的遺傳結構。為了更好地保護大斑石鱸種質資源, 今后的研究中應增加采樣地點和樣品量, 并采取多種分子標記分析大斑石鱸遺傳變異, 以期為制定科學管理保護措施提供理論依據。

[1] 陳再超, 劉繼興. 南海經濟魚類[M]. 廣州: 廣東科技出版社, 1982: 189. Chen Zaichao, Liu Jixing. Economic fishes of the South China Sea[M]. Guangzhou: Guangdong Science and Technology Press, 1982: 189.

[2] 朱世華, 鄭文娟, 鄒記興, 等. 5種石鱸科魚類細胞色素b基因序列及分子系統分析[J]. 熱帶海洋學報, 2006, 4: 41-45.Zhu Shihua, Zheng Wenjuan, Zou Jixing, et al. Molecular phylogenetic analysis of five Pomadasyidae fish based on mitochondrial cytochromeb sequences[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2006, 44: 41-45.

[3] 梁日深, 卓孝磊, 龍敏明, 等. 基于S7核糖體蛋白基因部分序列的石鱸屬魚類分子系統進化關系[J]. 海洋學報(中文版), 2013, 35(1): 165-171. Liang Rishen, Zhuo Xiaolei, Long Minming, et al. Molecular phylogenetic relationships of Pomadasys fishes based on partial S7 ribosomal protein gene sequences[J]. Acta Oceanologica Sinica, 2013, 35(1): 165-171.

[4] 任崗, 章群, 錢開誠, 等. 12種石鱸科魚類線粒體16S rRNA基因的部分序列分析[J]. 熱帶海洋學報, 2007, 3: 48-52. Ren Gang, Zhang Qun, Qian Kaicheng, et al. Sequence analysis of twelve grunt fishes based on 16S ribosomal RNA gene fragments[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2007, 3: 48-52.

[5] 劉朋朋, 鐘立強, 潘建林, 等. 基于線粒體D-loop區分析黃顙魚()5個淡水湖泊群體的遺傳多樣性[J]. 海洋與湖沼, 2013, 25(3): 728-733. Liu Pengpeng, Zhong Liqiang, Pan Jianlin, et al. Poplulation genetics in mitochondrial DNA control region for five fresh-water yellow catfish[J]. Ocenologia et Limnologia Sinica, 2013, 25(3): 728-733.

[6] Blin N, Stafford D W. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes[J]. Nucleic Acids Research, 1976, 3: 2303-2308.

[7] Excoffier L, Laval G, Schneider S. Arlequin version 3.01: An integrated software package for population genetics data analysis[J]. Evolutionary Bioinformatics, 2005, 1: 47-50.

[8] Fu Y X. Statistical tests of neutrality of mutations against population growth and background selection[J]. Genetics, 1997, 147(2): 915-925.

[9] 阮燕如, 周文漪, 李貴生, 等. 中國近海軍曹魚線粒體細胞色素b基因序列的遺傳變異[J]. 海洋漁業, 2014, 2: 97-101. Ruan Yanru, Zhou Wenyi, Li Guisheng, et al. On mtDNA cytochrome b gene sequence variation of Cobia () [J]. Marine Fisheries, 2014, 2: 97-101.

[10] Yokogawa K, Seki S. Morphological and genetic differences between Japanese and Chinese sea bass of the genus[J]. Ichthyol, 1995, 41(4): 437-445.

[11] Zang J B, Cai Z P, Huang L M, et al. Population genetic structure of crimson snapperin East Asia, revealed by analysis of the mitochondrial control region[J]. Journal of Marine Science, 63(4): 693-704.

[12] Xia J H, Huang J H, Gong J B. Significant population genetic structure of yellowfin seabreamin China[J]. Journal of Fish Biology, 2008, 73: 1979-1992.

[13] 陳竹, 鐘山, 羅大極, 等. 基于線粒體D-loop區比較分析野生與養殖斜帶髭鯛種群的遺傳多樣性[J]. 水生生物學報, 2011, 5: 761-767. Chen Zhu, Zhong Shan, Luo Daji, et al. Genetic diversity evaluation by the comparative analysis on mitochondrial D-loop area between wild and cultured population of[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2011, 5: 761-767.

[14] 薛丹, 章群, 郜星晨, 等. 基于線粒體控制區的粵閩三線磯鱸地理群體的遺傳變異分析[J]. 海洋漁業, 2014, 6: 496-502. Xue Dan, Zhang Qun, Gao Xingchen, et al. Genetic variations amongin coastal waters of southeast China based on mtDNA control region sequences[J]. Marine Fisheries, 2014, 6: 496-502.

Genetic diversity ofin coastal waters of South China Sea via mtDNA control region partial sequences

GAO Xing-chen1, 2, ZHANG Qun1, XUE Dan1, GONG Ya-yun1, CAO Yan1, HAN Bo-ping1

(1. Engineering Research Center of Tropical and Subtropical Aquatic Ecological Engineering, Ministry of Education, Department of Ecology, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2. Chinese Sturgeon Research Institute, China Three Gorges Corporation, Yichang 443100, China)Received：Nov. 18, 2014

; control region; genetic diversity

This study determined 993bp mtDNA control region sequences of 61 individuals collected in Dongxing, Wushi, Tanmen, and Zhapo where 35 variable sites defined 47 haplotypes. Global haplotype (Hd) and nucleotide diversity (Pi) were 0.9884 and 0.0076, respectively thus indicating a pattern of high haplotype diversity and low nucleotide diversity. A combination of the significant negative neutral test values of Fu’s Fs (?5.34,= 0.03), the mismatch distribution pattern, and the network analysis revealed that a historical population expansion occurred at about 47400–11800 years ago. The genetic distance between populations (0.0065–0.0089) was at a similar level to the genetic distance within populations (0.0066–0.0089); the overall genetic differentiation index (Fst) was ?0.0057 (> 0.05), the gene flow coefficient (Nm) among four populations was 33.76, and the analysis of molecular variance showed that most of the genetic variations of the four populations was distributed throughout the populations. In addition, genetic diversity was low and genetic divergence was inconspicuous between populations of. It is thus suggested thatin the coastal waters of the South Sea should be maintained as a single management unit and that the Tanmen population within contains arelatively high genetic diversity and should thus be a priority for protection.

Q958

A

1000-3096(2016)07-0041-05

10.11759//hykx20141118001

2014-11-18;

2015-03-27;

國家自然科學基金項目(41071034); 中央高校基本科研業務費專項資金(21613105, 21611426)

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No. 41071034; Fundamental Scientific Research Funds for the Central Universities No. 21613105, 21611426]

郜星晨(1989-), 男, 安徽淮北人, 碩士研究生, 主要從事魚類生態學研究, 電話: 15625163028, E-mail: 13039829682@126.com;章群,通信作者, E-mail: zhangqunjnu@gmail.com

(本文編輯: 譚雪靜)