MreB在鈍頂螺旋藻中的表達和定位

吳 娟, 金晨鐘, 胡一鴻, 胡軍和, 竺錫武, 徐 虹

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MreB在鈍頂螺旋藻中的表達和定位

吳 娟1, 2, 金晨鐘1, 胡一鴻1, 胡軍和1, 竺錫武1, 徐 虹2

(1. 湖南人文科技學院農業與生物技術學院, 湖南婁底 417000; 2. 廈門大學生命科學學院, 福建廈門 361102)

為了研究MreB在鈍頂螺旋藻形態建成中的作用, 克隆了基因并進行原核表達, 對表達的融合蛋白進行了純化, 免疫小鼠制備了MreB的多克隆抗體, 分別用Western blot和免疫熒光技術檢測不同形態藻絲體中MreB的表達和定位, 結果顯示MreB表達量在螺旋形和直線形兩種藻絲體中無明顯差異; 免疫熒光定位顯示, 熒光主要分布于細胞膜下一圈, 側面可觀察到熒光呈雙股螺旋狀分布。實驗結果說明, MreB含量不是導致螺旋藻形態改變的因素, MreB細胞骨架蛋白參與指導細胞壁肽聚糖的合成, 所以有可能通過其雙螺旋結構在藻細胞中的不對稱分布影響螺旋藻的形態。

螺旋形藻絲體; 直線形藻絲體; 細胞骨架蛋白

螺旋藻(), 又稱節旋藻(), 是一種光合放氧的原核絲狀微藻, 藻絲是由許多圓柱狀細胞連結而成的單列絲狀體, 其典型的形態學特征呈疏松或緊密的有規則的螺旋形或波浪形, 兩端鈍圓, 無分枝、無異形細胞。但是螺旋藻無論是在實驗室培養還是生產條件下都存在多形性變異現象[1]。有時在同一水體中的同一種螺旋藻形態也會有所不同, 據報道,當培養溫度和光照強度增高時, 螺距變小; 而在光密度很低情況下, 螺距很長, 超過100μm[2]。彭衛民等從正常培養的藻液中分離得到了顏色、長短、粗細均與螺旋形藻絲體相同的直線形變異藻株[1]。

原核細胞骨架蛋白MreB是真核肌動蛋白的類似物, 在維持細菌桿狀形態的功能中起了重要的作用[3-4]。它能在細胞生長或分裂時期分別在膜內側形成螺旋形或環狀結構, 并以此動態結構作為平臺, 在其上招募一些肽聚糖合成相關酶, 指導肽聚糖的合成, 形成新生細胞壁, 從而使細胞產生和保持特定的形態[5-7]。為了研究MreB在螺旋藻形態建成中的作用, 我們釣取了螺旋藻mreB基因序列, 克隆、表達、純化了鈍頂螺旋藻(FACHB869S)的MreB蛋白, 免疫小鼠并獲得相應的多克隆抗體, 用免疫印跡和間接免疫熒光標記技術對其表達量和細胞定位進行了研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

限制性內切酶、DNA Marker、T4DNA連接酶、酶等購自大連寶生生物有限公司; 山羊抗小鼠IgG-HRP 購自北京博大泰克生物基因技術公司; PVDF膜為MILLIPORE公司產品; 質粒提取試劑盒購自加拿大BIO BASIC公司; 熒光二抗(Fluorescein Conjugated Affinity Purified anti-Mouse IgG[Goat])購自美國Rockland 公司; IPTG、弗氏完全佐劑和不完全佐劑、丙稀酰胺、甲叉丙稀酰胺、Tris-base、甘氨酸、SDS、巰基乙醇、DTT、Triton X-100、尿素、TEMED、過硫酸氨、考馬斯亮蘭G250, 等均購自上海生工生物工程技術服務有限公司; 其余試劑和藥品均為國產分析純試劑和藥品。所有測序工作均由金思特科技(南京)有限公司完成。

FPROGO5D型PCR儀(美國 BIO-RAD公司); 超聲破碎儀(美國VirTis公司); 多用電泳儀(美國VirTis公司); Mini-PROTEAN 3 蛋白電泳系統(美國 BIO-RAD公司); 小型 Trans-Blot 電轉印系統(美國 BIO-RAD公司); 熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 藻種、菌種與質粒

實驗采用的鈍頂螺旋藻, FACHB編號分別為: 869和882, 分離的兩種形態分別標注螺旋形(spiral, S)、直線形(linear, L), 均購自中科院武漢水生所, 本實驗室保存。大腸桿菌BL21(DE3)plysS和質粒pGEX-6P-1由本實驗室保存。

1.3 實驗方法

1.3.1基因的擴增

按照茅云翔等的方法[8]提取鈍頂螺旋藻全基因組DNA, 以它為模板, 用引物P1: 5- AAGGAT CCATGGGCATAGACCTAGGAACCG-3; P2: 5-GAG AATTCCTACGGA TTTTGTG ATTGTCGTG -3(上海生工生物工程有限公司合成)進行擴增。反應液為50μL, 含有1×PCR buffer, 200μmol/L dNTP, 1.5mmol/L MgCl2, 0.6μmol/L引物, 50ng模板DNA, 2.5U酶。擴增條件為94℃預變性5min, 然后94℃ 45s, 58℃ 45s, 72℃ 90s, 35個循環, 最后于72℃保溫10min。擴增產物經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2質粒的構建

將以P1、P2為引物, PCR擴增的基因用H Ⅰ和R Ⅰ雙酶切, 經瓊脂糖凝膠電泳后挖膠回收1.1kb大小的mreB片段, 連接到經同樣雙酶切的pGEX質粒中, 通過測序確保插入的基因與質粒的閱讀框架一致。

1.3.3目的蛋白的誘導表達

將重組表達質粒pGEX-轉化BL21 (DE3)plysS, 然后涂布120 μg/mL Amp LB 培養基固體平板, 37℃培養過夜。挑取單菌落于4 mL LB 液體培養基(Amp100 μg/mL)搖至600=0.8~1.0時將菌液轉接于100 mL 培養基, 37℃搖至600= 0.7左右時, 加IPTG 至終濃度0.5 mmol/L, 然后將菌液轉至28℃誘導6h。5000 r/min 離心10min收集誘導培養的菌體, 將誘導的菌液經超聲破碎后分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE 電泳以分析蛋白的表達狀態。

1.3.4目的蛋白的純化

收集經IPTG誘導培養的菌體并重懸于PBS緩沖液中超聲破碎, 15000r/min離心10min取上清過預先平衡好的GST -Resin純化柱; 以20倍柱床體積的PBS緩沖液漂洗柱子; 1mL洗脫緩沖液(含6mM 還原型谷胱甘肽的PBS溶液)將目的蛋白從GST-resin純化柱上洗脫并收集。收集組分進行SDS-PAGE分析。

1.3.5多克隆抗體的制備

用原核表達并純化的GST-MreB免疫昆明小鼠。免疫前每只小鼠取20 μL 血清作為陰性對照備用。首次免疫用弗氏完全佐劑乳化GST-MreB 后, 采用腹腔和皮下多點混合注射, 腹腔注射100 μL, 皮下各點25 μL, 蛋白用量為200 μg/只。此后每隔7d 加強免疫一次, 共3 次。加強免疫用弗氏不完全佐劑, 所用劑量同首次免疫。30d 后摘眼球取血, 4℃靜置過夜, 取血清, –20℃保存。

1.3.6Western-blot 檢測

不同形態藻絲體總蛋白進行SDS-PAGE, 電轉移到PVDF 膜上, TBS 洗膜; 用含5%脫脂奶的TBST37℃封閉30min, TBST 洗膜; 一抗 1︰1000 稀釋, 分別加到相應的PVDF 膜上室溫孵育1h, TBST 洗膜; 加入1︰2000 稀釋的羊抗鼠IgG-HRP 室溫孵育1h, TBST 洗膜; 用化學發光法顯色定影于底片; 使用Image-Pro Plus 軟件進行蛋白定量分析, 分析結果來源于3次獨立實驗。

1.3.7MreB的免疫熒光定位

培養螺旋藻至560為 0.5~ 1.0, 4000 r/min 離心收集藻細胞, 加入適量PBS重懸藻細胞, 超聲波處理5 次, 輸出功率為5 W, 每次2s; 低速離心收集藻細胞, 用1.5 mol/L NaCl的Zarrouk培養基洗去細胞外壁的膠質鞘; 低速離心收集藻細胞, 轉入酶解液(0.2 mol/L磷酸鉀緩沖液pH7.2, 滲透穩定劑KCl 0.8 mol/L, 0.5%溶菌酶)中, 在28~30℃水浴低速震蕩下酶解1 h, 用PBS 洗滌3 遍, 每次5min; 用4%多聚甲醛常溫固定30min, PBS 洗滌3次; 冰甲醇處理5min, 冰丙酮處理30s; PBS 洗滌3次; 用含1% BSA的PBS封閉藻細胞1h, 加入小鼠多克隆抗體, 4℃孵育過夜; PBS 洗滌3次后, 用FITC標記的羊抗鼠熒光二抗孵育1h; PBS 洗滌4 次, 取一滴藻液于載玻片上, 加一滴防熒光萃滅劑, 蓋上蓋玻片, 用指甲油封片, 熒光顯微鏡下觀察MreB的細胞定位。

2 結果

2.1 鈍頂螺旋藻的克隆

取560為0.8左右的螺旋藻藻液50 mL, 離心后提取藻總DNA, 以總DNA 為模板, P1和P2為引物PCR擴增基因, 擴增產物經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 結果表明, 擴增產物的大小約為1100 bp, 與預期結果相符合(圖1)。

2.2 融合表達載體pGEX-的構建和鑒定

為了研究MreB在螺旋藻中的表達和定位, 需要將MreB進行外源表達純化后制備多克隆抗體。首先將經P1、P2 擴增并測序正確的片段用HⅠ+R Ⅰ雙酶切, 然后與同樣雙酶切的載體pGEX連接, 以構建原核表達質粒pGEX-。連接產物轉化DH5α, 經Amp抗性篩選后挑取陽性克隆菌落進行酶切鑒定。重組質粒經H Ⅰ+RⅠ雙酶切后進行電泳檢測, 結果顯示pGEX載體中已連入1100 bp 的單一片段(圖1)。該重組質粒經測序證實閱讀框正確。

M1. DL2000 DNA Marker; M2. λDNA/RI +dI Marker; 1. PCR production of; 2. pGEX-6P-1/HI; 3. pGEX- 6P-1-/HI; 4. pGEX-6P-1-B/HI +RI

2.3 MreB蛋白的表達純化

將鑒定正確的重組質粒pGEX-6P-1-轉化表達菌BL21, 用0.4mmol/L的IPTG 28℃誘導12 h, 提取菌體總蛋白進行SDS-PAGE分析。結果表明, pGEX-6P-1轉化菌誘導后比誘導前多一條分子量26ku的特異性GST蛋白條帶(圖2中的2), pGEX-6P-1-轉化表達菌株在約62ku處出現一條特異性蛋白條帶(圖2中的3和4)。將誘導的菌液經超聲破碎后分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析, 結果表明, GST-MreB融合蛋白主要存在于上清中(圖2中的5), 在上清中占總蛋白的50%以上。用GST.Bind resin純化, 純化后的GST-MreB融合蛋白經過SDS-PAGE分析表明, 純度都達到90%以上, 可用作抗原免疫小鼠。

1, 2. 分別為pGEX-6P-1轉化菌誘導前、后總蛋白; 3, 4. 分別為pGEX-6P-1-轉化菌誘導前、后總蛋白; 5, 6. 分別為轉化菌菌體裂解物上清, 沉淀; 7. 割膠純化后的GST-MreB

1, 2. Cell lysates respectively fromtransformed with empty pGEX-6P-1without or with IPTG induction (negative control); 3, 4. cell lysates respectively fromtransformed with pGEX-6P-1-without or with IPTG induction; 5, 6. soluble protein or insoluble protein fromtransformed with pGEX-6P-1-under IPTGinduction; 7. GST-MreB protein purified by GST.Bind resin agarose chromatograph

2.4 MreB抗體制備與檢測

用純化得到的融合蛋白作為抗原, 分別用弗氏完全佐劑充分乳化后, 按每只200μg來免疫小鼠, 第3周開始每隔一周加強免疫一次, 3次加強免疫后眼球取血, 分離血清得到融合蛋白的多克隆抗體。

為了檢測抗體的特異性, 我們用所制備的抗體與鈍頂螺旋藻的總蛋白進行了Western blotting, 以BL21轉化菌的純化蛋白為陽性對照, 抗體工作濃度為1︰1000。雜交結果顯示(圖3), 制備的抗體能與轉化菌中融合表達的GST-MreB蛋白產生特異性反應, 同時也能與鈍頂螺旋藻總蛋白產生雜交信號, 雜交帶的大小約為36ku, 符合MreB的大小, 且雜交信號基本單一, 背景干凈, 沒有其他非特異性雜交信號干擾。這說明, 我們以在BL21中表達的融合蛋白GST-MreB為抗原所制備的抗MreB抗體的特異性較好, 效價較高, 可用于鈍頂螺旋藻中MreB的表達檢測。

1: pGEX-6P-1-轉化菌誘導前總蛋白; 2: pGEX-6P-1-轉化菌誘導后總蛋白

1: Total protein fromtransformed with pGEX-6P-1-without IPTG induction; 2: Total protein fromtransformed with pGEX-6P-1-with IPTG induction

2.5 不同形態螺旋藻藻絲體中MreB蛋白的表達檢測

為了研究螺旋藻不同形態藻絲體的細胞骨架蛋白是否存在表達差異, 我們用所制備的鈍頂螺旋藻MreB抗體與鈍頂螺旋藻FACHB 869和882的螺旋形和直線形藻絲體的全蛋白進行了Western blot。采用篩絹過濾收集藻絲體, 以藻泥質量作為粗略的定量, 提取全蛋白后, 根據紫外吸收法測定蛋白濃度和SDS-PAGE的跑膠結果, 用緩沖液調整各蛋白樣品的濃度。為了更為準確的分析, 在Western blot檢測的過程中, 我們以生物鐘蛋白KaiC作為內參, 4種螺旋藻處于光暗(Dark 12h/Light 12h)周期誘導3d, 以便同步生物鐘蛋白KaiC的節律[9]。通過Image-Pro Plus軟件分析兩者的豐度比值, 對比目標蛋白在細胞內的表達情況。

在不同形態螺旋藻藻絲體中均能檢測到MreB特異性條帶, 大小約為36ku, 背景干凈(圖4)。從Image-Pro Plus 軟件分析結果可以看出(圖5), MreB的表達量在螺旋藻Spirulina platensis FACHB 882中直線形藻絲體比螺旋形稍高; 對于螺旋藻Spirulina platensis FACHB 869, 螺旋形藻絲體的MreB表達量比直線形稍高, 總體來看, MreB表達量在螺旋形和直線形兩種藻絲體中差異不明顯。

2.6 MreB在螺旋藻中的免疫熒光定位研究

按照方法1.3.7, 用帶熒光素FITC的熒光二抗免疫雜交檢測螺旋藻FACHB 869L和869S MreB蛋白的分布。因為螺旋藻有很厚的細胞壁, 且細胞壁外有膠質鞘覆蓋, 抗體很難直接進入胞內, 所以參照文獻[10]先用較高濃度的鹽處理可快速去除螺旋藻細胞外膠質鞘, 再用溶菌酶處理更有利于抗體進入胞內。但是溶菌酶也會作用于藻絲體中單個藻細胞之間相連的細胞壁, 藻絲體變成一個個藻細胞。可能是FACHB 869S的細胞壁比FACHB 869L更厚更堅實, 所以FACHB 869S的免疫熒光檢測效果不好(圖6B), 只有869L可以明顯的觀察到細胞內部熒光信號。在有熒光信號的藻細胞中, 熒光主要分布于細胞膜下一圈, 緊貼著細胞膜(圖6A白色箭頭所示); 藻細胞是扁圓柱狀, 側面可觀察到熒光呈雙股螺旋狀分布(圖6A白色箭頭所示)。

A. 869LMreB免疫熒光定位; B. 869S MreB免疫熒光定位

A. Immunofluorescence analysis for MreB location in linear filaments; B. Immunofluorescence analysis for MreB location in spiral filaments

3 討論

關于螺旋藻的直線突變株早就有報道, 我們實驗室從中科院武漢水生所購買的藻種里也含有兩種形態的藻絲體, 作者將其分離出來, 各自培養, 它們能長期保持其形態(至少在我們分離后的這四年里保持其形態), 未發生形態突變。生產上, 變直的螺旋藻不能適應高光強的生長環境、產量急劇下降、質量變差、藻絲體難以采收等一系列嚴重問題, 而帶來巨大的經濟損失[11-12]。因此, 迫切需要研究螺旋形態建成的外界影響因子及內在調控機理, 以指導生產實踐, 并進一步探索原核生物形態建成這一重要課題。根據我們實驗室之前所做的兩種螺旋藻蛋白表達差異分析, 對這些差異點的MALDI-TOF質譜鑒定, 數據庫比對分析, 選擇了細胞骨架蛋白MreB進行深入研究[13]。真核細胞骨架早已研究得較清楚了, 它們在細胞形態決定上起著重要的作用[14]。原核細胞形態更加多樣, 如球狀、桿狀、螺旋狀、月牙狀等, 而原核生物細胞骨架是近十年才發現的, 其機理尚不是很清楚, 目前普遍認同的觀點是細胞的形狀是由細胞骨架決定的, 并且通過結實的細胞壁的形成固定的。

本論文從原核細胞骨架蛋白MreB的角度出發, 探討螺旋藻形態建成與原核細胞骨架蛋白MreB之間的關系。利用免疫印跡(Western blot)技術檢測MreB 蛋白在鈍頂螺旋藻不同形態藻絲體中的表達情況, 發現MreB表達量在直線形藻絲體和螺旋形藻絲體中沒有明顯差異。以上實驗結果說明螺旋藻由螺旋形突變成直線形, MreB的含量改變不明顯, MreB含量不是導致螺旋藻形態改變的因素。

MreB作為主要原核細胞骨架蛋白之一, 其在細胞膜內側形成一個螺旋形的結構, 從細胞內部起到剛性的支撐作用, 而其更重要的作用在于, 作為一個平臺, 在其上招募一些肽聚糖合成相關酶, 指導肽聚糖的合成[5, 7, 15]。如果形成螺旋形藻絲體, 則每個細胞兩側的細胞壁是不對稱生長的, 而直線形突變株兩側的細胞壁是平衡生長的。Vats P等[16]報道, 在中GFP-標記的MreB蛋白在熒光顯微鏡下, 有雙螺旋、雙環、單環三種主要的定位方式。螺旋狀分布與環狀分布是相互轉換的, MreB相關細胞骨架隨著細胞周期改變其結構模式[17]。細胞分裂時, MreB纖維由原來擴展的螺旋狀態縊縮為環狀定位于細胞未來分裂位點附近, 單環隨后轉變為雙環位于Z環(又稱為細胞分裂環)的兩側, 雙環逐漸分開, 環分配到每個細胞的一極[18-19]。用間接免疫熒光技術檢測螺旋藻MreB分布, 因為螺旋藻具有堅實的細胞壁, 如果不用溶菌酶對細胞壁進行部分降解, 一抗和二抗無法進入胞內, 我們能夠觀察到二抗熒光信號的都是細胞壁部分降解而形成的單個藻細胞。從藻細胞的橫截面, 可以看到熒光主要分布于細胞膜下一圈, 這與細菌中MreB細胞骨架沿細胞長軸螺旋狀環繞于細胞膜內側是一致的[17]; 藻細胞是扁圓柱狀, 長度很短直徑很大, 從側面可看到熒光的雙股螺旋狀分布。這些說明螺旋藻中MreB的分布與菌中類似, 但是螺旋藻細胞的MreB雙螺旋比菌的螺距短、螺旋度大, 這是因為藻細胞是扁圓柱狀, 大腸桿菌比藻細胞長, 而直徑則比藻細胞小, 這類似于將一根螺旋絲拉長了, 螺距就變大了, 螺旋度就變小了, 這也反映了MreB對細胞寬度及長度的調控作用[6, 20]。

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Expression and Localization of MreB in

WU Juan1, 2, JIN Chen-zhong1, HU Yi-hong1, HU Jun-he1, ZHU Xi-wu1, XU Hong2

(1. Institute of Agriculture and Biotechnology, Hunan University of Humanities, Science and Technology, Loudi 417000, China; 2. School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China)Received：Oct. 9, 2015

spiral filament; linear filament;; cytoskeletal protein

To explore the function of MreB in morphogenesis of, we clonedgene into expression vector pGEX-6P-1 and expressed GST-tagged MreB in. The purified MreB protein was used to immunize mice to prepare polyclonal antibodies. No obvious differential expression of MreB was detectedby western blot analysis between the spiral filaments and linear forms of. Immunofluorescence analysis showed that MreB was distributed as a ring or double helix under the cell membrane. These results showed that MreB might not directly regulate the shapes of the cell. The helical MreB cytoskeletal protein directs the synthesis of lateral peptidoglycan by providing a track, therefore, it may affect the morphogenesis ofby the asymmetric distribution.

Q942.3

A

1000-3096(2016)07-0017-06

10.11759/hykx20140323003

2015-10-09;

2016-03-22;

國家自然科學基金項目(40306024, 31301978); 湖南農田雜草防控協同創新中心資助項目

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No.40306024, No.31301978; Hunan Provincial Collaborative Innovation Center for Farmland Weeds Control]

吳娟(1984-), 女, 湖南婁底人, 講師, 研究方向: 植物分子生物學, E-mail: wujuan20022499@126.com;徐虹,通信作者, 電話: 18959282580, E-mail: hxu@xmu.edu.cn

(本文編輯: 梁德海)