蚯蚓小分子多肽提取物的制備及抗氧化活性

劉廷強　嚴澤民　周華峰

摘要：研究了自溶酶解制備蚯蚓小分子多肽提取物的工藝，并對其抗氧化活性進行了初步研究。通過單因素和正交試驗法，以肽的得率為評價指標，確定了最佳制備工藝：反應時間1 h，料液比1.0 g ∶ 1.5 mL，溫度35 ℃，pH值676。在此工藝條件下，1.7 kg鮮蚯蚓制自溶酶解，酶解液經分子膜截留并冷凍干燥，共得到了103.39 g蚯蚓小分子多肽提取物。該產品為微黃色粉末，略帶獨特香味，主要為相對分子質量3 000以下的小分子多肽和氨基酸。在濃度為10、30 mg/mL時，蚯蚓小分子多肽提取物對DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除率分別為91.1%、53.0%。

關鍵詞：蚯蚓；自溶酶解；小分子多肽；抗氧化

中圖分類號： TS201.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0463-04

蚯蚓為環節動物門（Annelida）寡毛綱（Oligochaeta）動物，可改良土壤，促進農業增產，在物質循環、生物多樣性、保護生態環境等方面發揮著特殊作用。此外，蚯蚓還是我國常用中藥，名為地龍。研究發現，蚯蚓具有治療心血管疾病[1-2]、癌癥[3]、哮喘[4-5]等多種藥理作用，同時還具有增強免疫力[6-7]、促進傷口愈合[8]等作用。蚯蚓中含有豐富的人體所需營養物質[9-10]，包括蛋白質、核酸、微量元素、維生素等，其中蛋白質總量約占干質量的45.90%～68.11%。蚯蚓經酶水解可獲得小分子多肽和氨基酸，不僅可以提供均衡的、易于吸收的營養物質，而且蚯蚓肽還具有抗氧化[11]、增強免疫[12]、抗菌[13]等生理活性，在保健食品領域具有潛在的應用前景。蚯蚓自身含有豐富的蛋白酶，在一定條件下容易發生自溶酶解。目前，通過外源蛋白酶或自身酶水解制備蚯蚓酶解物研究已有相關報道[14-17]，但制備工藝主要以生成氨基酸為主。本研究以肽的得率為評價指標，結合單因素法和正交試驗法，對蚯蚓自溶酶解工藝進行優化，采用分子膜截留技術，去除蚯蚓自身腥味，制備略帶香味的蚯蚓小分子多肽提取物，并考察其抗氧化活性，旨在為開發高附加值的蚯蚓保健食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

赤子愛勝蚓（Eisenia foelide，天津賈立明蚯蚓養殖有限公司）；溶菌酶（14 000 Da，華美生物工程公司）；胰島素（5 733 Da，徐州萬邦金橋制藥有限公司）；桿菌肽（1 422 Da，Sigma公司）；谷胱甘肽還原型（307 Da，Sigma公司）、DPPH（Sigma公司）；其他化學試劑均為國產分析純試劑。TOSOH TSK-Gel-2000 SWXL色譜柱（300 mm×7.8 mm）；Agilent 1200系列高效液相色譜儀；TU1900紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；L-8900氨基酸分析儀（日本日立公司）。

1.2 方法

1.2.1 自溶酶解處理方法 將鮮蚯蚓洗凈，置于純凈水中讓其盡量吐出體內的食物殘渣。用高速搗碎機將洗凈的鮮蚯蚓搗碎，蚯蚓搗碎液即為鮮蚯蚓原液。在蚯蚓原液中加入一定體積的去離子水，混勻，在一定條件下進行自溶酶解反應，反應結束后，于沸水浴酶滅活5 min，經12 000 r/min轉速離心 10 min，上清液即為自溶酶解液。每個試驗重復3次。

1.2.2 肽得率測定方法 采用雙縮脲試劑法[18]，檢測蚯蚓自溶酶解液中肽的濃度。自溶酶解液加入等體積的10% TCA溶液，靜置30 min，離心，取1 mL上清液，補水至2 mL，在540 nm處測定D值。以桿菌肽為對照，參照標準曲線的回歸方程y=0.061 49x+0.004 22 （r2=0.996 58），計算肽濃度。肽得率計算公式如下：

肽得率=肽的濃度×酶解液體積/樣品濕質量×100%。

1.2.3 蚯蚓自溶酶解工藝的優化

1.2.3.1 pH值對自溶酶解條件的影響 取 1 g蚯蚓搗碎液，加入1 mL去離子水，混勻，經測定混合液pH值為6.76。分別在pH值為6.0、6.5、6.76、7.0、7.5、8.0條件下進行自溶酶解，于最佳反應溫度條件下反應4 h。分別檢測自溶酶解液中肽的濃度，計算肽得率。

1.2.3.2 溫度對自溶酶解條件的影響 取1 g蚯蚓搗碎液，加入1 mL去離子水，混勻，分別于30、35、40、45、50、55、60 ℃下反應4 h。分別檢測自溶酶解液中肽濃度，計算肽得率。

1.2.3.3 料液比對自溶酶解條件的影響 取 1 g蚯蚓搗碎液，分別加入不同體積的去離子水，混勻，配制成1.0 g ∶ 1.0 mL、1.0 g ∶ 1.5 mL、1.0 g ∶ 2.0 mL、1.0 g ∶ 2.5 mL、1.0 g ∶ 3.0 mL料液比的蚯蚓混合液，于最佳pH值和溫度條件下反應4 h。分別檢測自溶酶解液中肽的濃度，計算肽的得率。

1.2.3.4 反應時間對自溶酶解條件的影響 于最佳pH值、溫度和料液比條件下，分別自溶酶解1、2、3、4、5、6、7 h。反應結束后，分別檢測自溶酶解液中肽的濃度，計算肽的得率。

1.2.3.5 正交試驗 在單因素試驗結果基礎上，按照表1所示的4因素3水平設計正交試驗。

1.2.4 HPLC檢測肽的分子量分布情況 采用HPLC對蚯蚓自溶酶解物中肽的分子量分布情況進行分析。檢測條件：乙腈 ∶ 水 ∶ 三氟乙酸=20 ∶ 80 ∶ 0.1；流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：220 nm。采用溶菌酶、胰島素、桿菌肽、谷胱甘肽還原型為對照，以相對分子質量的對數對保留時間作線性回歸，得到標準曲線方程y=8.342-028x（r2=0.988 25）。

1.2.5 蚯蚓小分子多肽提取物的制備 在自溶酶解最優工藝條件下，對1.7 kg鮮蚯蚓進行自溶酶解。酶解原液首先經相對分子質量為3 000的超濾膜進行超濾，濾液再經相對分子質量為300的納濾膜進行截留，截留液冷凍干燥，即為蚯蚓小分子多肽提取物。采用HPLC檢測肽的分子量分布情況。

1.2.6 蚯蚓小分子多肽提取物總氮含量及游離氨基酸含量的檢測 參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》規定的方法，采用凱氏定氮法，對蚯蚓小分子多肽提取物總氮含量進行分析。參照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》規定的方法，用3%磺基水酸溶液溶解樣品并定容，樣品溶液搖勻后過濾、離心，采用日立L-8900氨基酸分析儀測定上清液，對蚯蚓小分子多肽提取物中16種游離氨基酸進行分析。

1.2.7 蚯蚓小分子多肽提取物的體外抗氧化活性檢測 參照前人研究方法[19]，分別以α-熊果苷和維生素C為陽性對照，檢測蚯蚓小分子多肽提取物對DPPH自由基和超氧陰離子的清除作用，考察其體外抗氧化活性。

2 結果與分析

2.1 pH值對蚯蚓自溶酶解的作用

以肽的得率為評價指標，考察pH值對自溶酶解的作用。由圖1可知，當pH值低于7.0（即6.0、6.5、6.76）時，肽的得率差別不大。當pH值大于6.76時，肽得率開始下降并趨于穩定。蚯蚓勻漿液和水混合時，其pH值為6.76左右，因此選擇6.76作為自溶酶解試驗的pH值。

2.2 溫度對蚯蚓自溶酶解的作用

由圖2可知，在35 ℃自溶酶解時，肽的得率最高。隨著溫度的上升，肽的得率緩慢下降。但在60 ℃時，肽的得率反而增大。雖然在60 ℃時仍可以獲得較高得率，但是溫度過高容易導致蛋白質、肽活性發生改變。因此，選擇35 ℃為自溶酶解試驗的溫度。

2.3 料液比對蚯蚓自溶酶解的作用

由圖3可知，隨著加水量的增大，蚯蚓肽的得率首先緩慢上升，然后緩慢下降，在料液比為1.0 g ∶ 2.0 mL時達到最大。因此，選擇料液比為1.0 g ∶ 2.0 mL。

2.4 反應時間對蚯蚓自溶酶解的作用

由圖4可知，在自溶時間為1 h時，肽的得率最高，隨著自溶時間的延長，肽的得率逐漸降低。

2.5 正交試驗法優化蚯蚓自溶水解條件

在單因素試驗基礎上，通過正交試驗考察各因素之間的關系，結果如表2所示。

由表2可知，蚯蚓自溶酶解時間、料液比對肽的得率影響較大。最佳自溶條件為時間1 h，料液比為1.0 g∶ 1.5 mL，溫度為35 ℃，pH值為6.76。在此條件下，肽的得率可達到163%。

2.6 蚯蚓小分子多肽提取物的小試制備

1.7 kg鮮蚯蚓在最優工藝條件下進行自溶酶解，自溶酶解原液經相對分子質量為3 000的超濾膜過濾，濾液再經相對分子質量為300的納濾膜截留，截留液冷凍干燥，共制備得到103.39 g蚯蚓小分子多肽提取物，去除蚯蚓本身腥味，略帶獨特香味。經雙縮脲試劑法檢測，肽的含量約為27.8%。采用HPLC法對自溶酶解原液和蚯蚓小分子多肽提取物分別進行檢測，檢測結果如圖5所示。

經對照標準蛋白出峰時間，蚯蚓自溶酶解原液中主要為小分子多肽和氨基酸，但仍有較多的大分子肽和蛋白質。與自溶酶解原液相比，通過分子截留技術獲得的蚯蚓小分子多肽提取物主要為相對分子質量3 000（保留時間為17.352 min）以下的小分子多肽及氨基酸，不含大分子的多肽和蛋白質。

2.7 蚯蚓小分子多肽提取物總氮含量及游離氨基酸含量

經凱氏定氮法檢測，每100 g蚯蚓小分子多肽提取物樣品中總氮含量為12.0 g，以換算系數6.25計算，蛋白質含量約為75%左右。如表3所示，蚯蚓小分子多肽提取物樣品中16種游離氨基酸總含量為35.5%。每100 g樣品中含有賴氨酸1.59 g，苯丙氨酸2.79 g，蘇氨酸3.18 g，異亮氨酸 2.43 g，亮氨酸5.65 g，纈氨酸2.48 g。

2.8 蚯蚓小分子多肽提取物的抗氧化活性

采用DPPH法檢測蚯蚓小分子多肽提取物對DPPH自由基的清除作用，以α-熊果苷為陽性對照，結果如圖6所示。

由圖6可知，低濃度時，α-熊果苷對DPPH自由基的清除作用較為明顯，0.8 mg/mL α-熊果苷處理下，DPPH自由基清除率達84.3%。低濃度LMWPEE處理下，蚯蚓小分子多肽提取物對DPPH自由基具有清除作用，但效果不明顯，隨著LMWPEE濃度的升高，對DPPH自由基的清除作用逐漸增強。當LMWPEE濃度升至5 mg/mL時，DPPH自由基清除率為48.3%；當LMWPEE濃度進一步升高至10 mg/mL時，DPPH 自由基清除率達91.1%。

采用鄰苯三酚法檢測蚯蚓小分子多肽提取物對超氧陰離子自由基的清除作用，以維生素C為陽性對照，結果如圖7所示。維生素C濃度較低時，維生素C對超氧陰離子自由基的清除作用較為明顯；當維生素C濃度為0.5 mg/mL時，清除率達92.5%。LMWPEE對超氧陰離子自由基有一定的清除作用，當LMWPEE濃度為10 mg/mL時，超氧陰離子自由基清除率為20.7%；當LMWPEE濃度達30 mg/mL時，超氧陰離子自由基清除率達到53.0%。

綜合體外抗氧化活性的檢測結果，蚯蚓小分子多肽提取物對自由基的清除作用具有一定的選擇性，高濃度下對 DPPH 自由基的清除作用較為明顯，對超氧陰離子自由基具有一定的清除作用。

3 結論

目前，蚯蚓蛋白質水解工藝主要以生成氨基酸為主。劉波等通過外源酶和內源酶水解獲得的產物中，相對分子質量220以下的含量約72%，即氨基酸含量都接近72%[15-16]。李國雷等通過加長自溶酶解時間至48 h，獲得的酶解產物中氨基酸含量更高，約78%[14]。這些研究報道并未對水解產物進行進一步處理，水解液不僅仍帶有蚯蚓自身的腥味，且不利于保存。本研究首次采用雙縮脲試劑法，以肽的得率為評價指標，對蚯蚓自溶酶解工藝進行優化。確定了蚯蚓自溶酶解的最佳制備工藝為：反應時間1 h，料液比1.0 g ∶ 1.5 mL，溫度35 ℃，pH值6.76。同時，采用分子膜截留技術和冷凍干燥技術，對酶解液進行處理，制備獲得了蚯蚓小分子多肽提取物。去除了蚯蚓自身所帶的腥味，產品為微黃色、略帶香味的粉末，主要含有相對分子質量3 000以下的小分子多肽和氨基酸，16種游離氨基酸總含量為35.5%。通過雙縮脲試劑法檢測，肽的含量為27.8%，由于該檢測法對二肽靈敏度不高，因此肽的實際含量應更高。在濃度為10、30 mg/mL時，蚯蚓小分子多肽提取物對DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除率分別為91.1%、53.0%。本研究制備工藝簡單，不引入其他外源蛋白酶，去除了蚯蚓自身腥味，制備獲得了微黃色粉末狀、略帶香味的蚯蚓小分子多肽提取物。該產品不僅具有均衡的營養物質，而且具有較好的抗氧化活性，可應用于抗衰老和增強免疫等功能的保健食品開發。

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