遼寧省慢生根瘤菌的系統發育多樣性

張艷華　王惠　王巖

摘要：花生是重要的豆科經濟作物，能與慢生根瘤菌屬的根瘤菌共生固氮，遼寧省的花生種植較廣泛，但是對該地區花生根瘤菌的研究并不全面。采用16S rDNA和nifH基因的序列分析方法從遺傳學角度對17株分離自遼寧省不同地區的花生根瘤菌的特性進行研究。根據16S rDNA基因的序列分析將所有菌株分為4個類群，而nifH基因的序列分析方法將供試菌株分成兩大類群，2種方法的分類結果大體一致，測序結果表明所有菌株都屬于慢生根瘤菌屬。說明遼寧省花生慢生根瘤菌的分布可能與該地的地理環境存在一定的相關性。

關鍵詞：花生；慢生根瘤菌；系統發育多樣性

中圖分類號： S182 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0067-04

根瘤菌是能與豆科植物的根部組織建立共生固氮系統的土壤微生物，通過此共生固氮系統固定的氮素量對于陸地生態系統來說非常重要[1-2]，而且有利于農業、林業和退化土地復墾的可持續發展[3]。通常認為，共生根瘤菌分布于α-變形菌門的根瘤菌屬、慢生根瘤菌屬、中華根瘤菌屬、中慢生根瘤菌屬、異根瘤菌屬和固氮根瘤菌屬[4]，但是隨著根瘤菌分類學的發展，目前已經發現一些屬于β-變形菌門的根瘤菌，例如伯克氏菌屬和貪銅菌屬的微生物[5]。

花生（Arachis hypogaea L.）別稱落花生，是一種重要的農業和經濟豆科作物，可被用作糧食作物、油料作物和用于生產多種食品，通常認為可與慢生根瘤菌共生進行固氮，其耐旱性、固氮能力和耐陰性使其成為與玉米、高粱、谷子和其他禾本科作物進行間作的重要豆科植物[6]。我國是世界上花生的進出口大國，花生產業的發展對于增加農民收入、促進國內食品安全發展和改善人們生活水平有重要的意義。

共生固氮效力是衡量花生與本土根瘤菌共生系統的重要因素。在花生種植上接種根瘤菌有很好的固氮效果，然而固氮效果受所接種根瘤菌與本土根瘤菌間的競爭影響很大[7]，因此，從本地篩選出具有結瘤、固氮和高效競爭能力的根瘤菌菌株非常重要[8]。然而，盡管花生在遼寧省種植較廣泛，但是關于本地根瘤菌系統發育多樣性的相關報道并不多，本研究的目的在于通過對16S rDNA和nifH基因序列差異性分析，對本地花生根瘤菌的特性、種群和系統發育多樣性進行研究，評估地理變異，有助于改善豆科作物接種根瘤菌、提高固氮量的策略[9-10]。

1 材料與方法

1.1 菌株的采集

本研究所用菌株的來源和地理環境列在表1中。所選菌株直接分離自遼寧省不同地理區域所種植的花生根瘤中，每株植物上隨機采集1～2個紅色根瘤，從根瘤中分離細菌的方法如下：根瘤用95%乙醇表面消毒30 s，隨即在0.1% HgCl2溶液中浸泡3～5 min，然后用無菌蒸餾水洗滌5～6次，夾破根瘤并在含有剛果紅的酵母浸出物-甘露醇培養基（YMA）平板上劃線[11]，將平板置于28 ℃條件下培養2～7 d長出單菌落，隨后挑取長出的分離物，經過稀釋涂布平皿純化，挑取單菌落，-80 ℃冰凍保存在含有20%甘油的YMA液體培養基中[7]。根據菌株較慢的生長速度和在含有溴麝香草酚藍（BTB）的YMA平板上產堿（培養基由草綠色變為藍色）初步推斷屬于慢生根瘤菌屬[12]。通過結瘤試驗驗證菌株是否具有使花生結瘤的能力。

1.2 結瘤試驗

對所有供試菌株包括從中國科學院沈陽應用生態研究所獲得的參照菌株（慢生根瘤菌屬的1 024菌株）在實驗室進行盆栽結瘤試驗?；ㄉN子表面消毒的方法與前面根瘤表面消毒的方法相同[11]，置于含有濕潤紗布的無菌平板中在28 ℃條件下催芽，待胚芽長到約2.0 cm時，播種到裝有蛭石和無氮營養液并在121 ℃下滅菌1 h的玻璃罐中，每罐播種2粒，并在根部接種1 mL供試菌的菌懸液（約0.1億個細胞/mL），每個處理設置5個重復并設置空白對照。將盆栽置于特定的環境下培養（28 ℃，每天光照16 h，相對濕度50%），適當補澆無菌水，每月澆2次無氮營養液[11]。接種45 d后收獲植株，記錄每個處理的結瘤數。內部呈現紅色的根瘤視為有效根瘤。

1.3 DNA提取

提取DNA前，將供試菌株在YMA平板上劃線活化，28 ℃ 培養至長成單菌落，挑取單菌落接種到YMA液體培養基中長至對數期（0.4<0.6）用于提取總DNA，用細菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取DNA。

1.4 PCR擴增和16S rDNA基因序列測定

選取每一樣地的代表菌株，DNA提取后，用引物fD1（5′-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和rD1（5′-CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3′）擴增16S rDNA基因。PCR程序按照Weisburg等的方法[9]操作，在1%瓊脂糖凝膠電泳上進行PCR產物效果檢測，凝膠成像系統拍照，效果較好的產物送至生物公司進行測序。

1.5 PCR擴增和nifH基因序列測定

由于nifH基因編碼固氮還原酶，為了研究根瘤菌的共生特性，筆者分析了nifH基因，用特異性引物nifHF（5′-TACGGNAARGGSGGNATCGGCAA-3′）和nifHR（5′-AGCATGTCYTCSAGYTCNT CCA-3′）擴增nifH基因，PCR程序參考Gurkanli等的研究[13]。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測，凝膠成像系統拍照，送至生物公司進行測序。

1.6 系統發育分析

通過NCBI上的BLAST工具進行菌株的同源性分析，在BLAST數據庫獲取相似序列以及慢生根瘤菌屬參比菌株的基因序列，用MEGA 4.0軟件的CLUSTAL W功能進行相似性比對[14]，序列比對后，用MEGA 4.0采用鄰接法構建系統發育樹[15]。發育樹的自展檢驗對每個序列隨機選取500個重復來評估發育樹拓撲學的可靠性，用Kimura 2-Parameter模型（K2P）來計算基因間距離。

1.7 核苷酸序列入庫編號

12個菌株的16S rDNA基因的核苷酸序列和17個菌株的nifH基因的核苷酸序列存放在GenBank中，序列編號分別為KR092316-KR092327和KR092328-KR092344。

2 結果與分析

2.1 菌株的生長性能

本研究中的所有供試菌株都能使花生結瘤，初步證明這些菌株都屬于根瘤菌。28 ℃條件下，供試菌株在YMA平板上長出單菌落約需要1周的時間，菌落呈乳白色，不透明或半透明，邊緣光滑，所有菌株因產生堿性物質而使含有BTB的YMA培養基平板由草綠色變為藍色（圖1）。這一結果進一步表明供試菌株屬于慢生根瘤菌屬。

2.2 16S rDNA的系統發育分析

每個供試菌株的16S rDNA基因PCR擴增后都產生約145 kb的單一條帶。對從不同地區采集的12株代表菌株的16S rDNA序列的BLAST進行分析，結果表明它們都屬于慢生根瘤菌屬，與Bradyrhizobium japonicum有最大的相似性。

根據遼寧省本土花生慢生根瘤菌16S rDNA基因序列所做的系統發育分析結果見圖2。與最相近的參考菌株有至少97%的序列相似性作為菌株分群的標準，在16S rDNA基因的系統發育分析中，所有菌株被分為4個類群，不同地區菌株的區別顯示在系統發育樹上（圖2）。所分成的4個類群都與B. japonicum有較高的序列相似性，F3屬于類群Ⅰ，它分離自遼寧省的北部，與B. japonicum USDA6最相近，相似性達到99%；C1、F2、F4和O屬于類群Ⅱ，它們分離自遼寧省的北部和中部。菌株B2、H4、G2、J1、J3和4被歸為類群Ⅲ，除了H4

分離自遼寧省的北部，其余的都是在遼寧省的西部地區采集的；僅P2菌株歸為類群Ⅳ，它分離自遼寧省的西部。由于采集自同一地區的菌株樣本有被歸到不同類群的現象，16S rDNA類型與地理位置的相關性不太明顯，但仍然有一定的相關性。

2.3 nifH基因的系統發育分析

每一菌株的nifH基因PCR產物均產生約0.75 kb的單一條帶。對17株菌株測序結果進行BLAST，都顯示與慢生根瘤菌屬的菌株有較高的同源性。根據遼寧省本土花生慢生根瘤菌nifH基因序列測定結果所進行的系統發育分析見圖3。以與最近的參考菌株有不少于97%的序列相似性作為菌株分群的標準，系統發育樹可分為兩大類群，都屬于B. japonicum，與B. japonicum USDA110有至少97%的序列相似性，每一類群與相應地理區域大致對應。類群A的菌株包括P2、H4、4、F3、F4、01、F1、F2、C1，屬于北部和中部氣候區，類群B菌株包括B3、B4、B1、B2、E1、J1、G2、J3，分離自西部和中部地區。與16S rDNA基因序列分析相比，nifH基因的共生基因類群A對應16S rDNA基因類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ，nifH基因類群B與 16S rDNA 基因類群Ⅲ相對應，都屬于B. japonicum。

3 結論與討論

在本研究中，從遼寧省不同地區的花生種植區分離出17株根瘤菌，依據回接結瘤能力、在含有BTB的YMA平板上產生堿性物質的能力、16S rDNA和nifH基因序列分析的結果，這些菌株都被歸為慢生根瘤菌屬。16S rDNA基因和管家基因常被用作分子系統學分類和評估慢生根瘤菌系統發育關系的的標記。本研究中，通過16S rDNA和nifH基因序列分析證明17株菌株都屬于B. japonicum，即B. japonicum是遼寧省慢生根瘤菌的優勢種。遼寧省的地勢北部高，南部地，從陸地向海洋傾斜，可以大致的分為3個地理區域：西部高地、中部平原、東部丘陵。因此，地勢的差異可能影響本土根瘤菌的分布，在本研究中，依據16S rDNA基因的系統發育分析，供試菌株被分為4個類群，所有類群都與B. japonicum有較高的序列相似性，而依據nifH基因序列的系統發育樹將供試菌株分類兩大類，在這2種系統發育樹間有較大的相似性，與16S rDNA基因序列分析相比，nifH基因的共生基因類群A對應16S rDNA基因類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ，nifH基因類群B與16S rDNA基因類群Ⅲ相對應，從每一類群中菌株的分布可以推測地理因素與本土根瘤菌的分布有一定的相關性。

然而，由于每一樣地取樣量相對較小，降低了供試菌株的數量，可能低估了遼寧本地慢生根瘤菌的生物多樣性。盡管有些研究報道了有快生根瘤菌使花生結瘤的現象[16-17]，但與花生共生結瘤的菌株大部分都屬于慢生根瘤菌[18-20]，在本研究中，從花生根瘤中只分離出慢生根瘤菌，并未見快生菌結瘤的現象。

有研究顯示，根瘤菌的分布、多樣性和本土性受土壤類型和氣候環境影響[11，21-22]。在對大豆所作的研究中，溫度和土壤pH值與尼泊爾地區根瘤菌種水平的分布有很大的相關性[10]。Dinesh等也報道了尼泊爾地區不同地理環境豇豆根瘤菌的分布多樣性[23]。

總之，盡管本研究中供試菌株的多樣性并不高，但是也對遼寧省不同地理區域本土花生慢生根瘤菌系統發育多樣性進行的初步分析。結果顯示，遼寧省花生慢生根瘤菌可能依賴于地理位置而分布，這也暗示本土慢生根瘤菌的分布與環境因素間的相關性。在今后的工作中，有必要增大采樣量對遼寧地區花生根瘤菌多樣性進行深入研究。

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