辣椒花器官發(fā)育相關PAP3基因的克隆與生物信息學分析

馬寧　鮑順淑　連青龍

摘要：AP3基因屬于MADS-box基因家族中控制花器官發(fā)育的B類基因，與PI基因一起參與控制植物花瓣和雄蕊的形成。克隆到了辣椒控制花器官發(fā)育的PAP3基因（GenBank登錄號：HM104635），該基因全長929 bp，編碼226個氨基酸，具有典型的MADS結構域和K結構域；與其他6種植物同源基因比對顯示，它們的氨基酸序列相似性在82%～91%之間；系統(tǒng)進化樹分析表明，PAP3屬于MADS-box基因家族中的AP3/PI亞族成員，與辣椒花器官發(fā)育相關。

關鍵詞：辣椒；PAP3基因；花器官發(fā)育；生物信息學

中圖分類號： S641.303.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0052-03

AP3基因均屬于MADS-box基因家族中控制花器官發(fā)育的B類基因。參與調控高等植物花器官發(fā)育的 MADS-box基因是近年來植物發(fā)育生物學研究的熱點，目前已經(jīng)在多種作物上克隆到B類基因[1-2]。經(jīng)研究表明，B類基因參與花瓣、雄蕊的形成。在喪失功能的突變體中，萼片代替第2輪花瓣，第3輪雄蕊轉變?yōu)樾钠3-4]，植物B類基因結構屬于植物MADS-box基因家族，含有相同的4個區(qū)域：MADS結構域、K結構域、I結構域和C結構域。啟動子表達特性的分析顯示，AP3基因啟動子為花器官特異表達啟動子[5]。最新研究表明，AP3基因的表達形式取決于編碼轉錄因子的分生組織特征基因LEAFY、AP1，并且配合著不尋常的花器官活動，編碼了F-BOX蛋白[6-8]。AP3在擬南芥花瓣、雄蕊的整個發(fā)育過程中均有表達，但是在非花組織中不表達[9-11]。

本研究從實驗室已經(jīng)構建的辣椒不育系和恢復系的差減cDNA文庫中獲得辣椒恢復基因誘導的EST片段TA288[12]，利用RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技術進行全長cDNA克隆，獲得了辣椒花器官發(fā)育PAP3基因的全長，并利用 RT-PCR 技術、Northern blot技術檢測了該基因在辣椒不同材料、不同器官上及小孢子發(fā)育的不同時期的表達量差異，以期為闡明辣椒花器官發(fā)育的分子調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以辣椒細胞質雄性不育系121A及其相應的恢復系121C為試驗材料（筆者所在實驗室育種材料）。2012年春季在中國農(nóng)業(yè)大學上莊實驗站大棚內常規(guī)種植。在開花期，取121C花瓣已開始變白的花蕾，剝取花藥后立即用液氮冷凍并在-70 ℃保存?zhèn)溆茫糜诨蛉L克隆。

1.2 總RNA的提取及基因的全長克隆

總RNA的提取依照SV Total RNA Isolation System kit（美國 Promega 公司）操作說明書進行。基因全長克隆采用 RACE 技術，按照 Smart Race cDNA Amplification Kit（美國 Clontech 公司）試劑盒說明書進行。根據(jù)實驗室已經(jīng)獲得的 EST 片段分別設計 3′端、5′端特異引物（5′-TGAGTGTGCGAATGATTGCTGGGGGTTT-3′）、（5′-ACCCCCAGCAATCATTCGCACACTCAAA-3′）進行cDNA末端快速擴增（RACE）。擴增產(chǎn)物采用北京鼎國生物技術有限責任公司的DNA凝膠回收試劑盒回收。插入pGEM-T Easy載體（美國Promega公司），熱激法轉化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞（中國天根公司）中，在氨芐青霉素平板上進行陽性克隆篩選，送交三博遠志生物技術有限公司測序。測序結果在NCBI網(wǎng)站上 進行Blast比對，用 DNAMAN軟件進行序列分析，用MEGA 41軟件構建系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 辣椒PAP3基因的克隆與序列分析

在已經(jīng)構建的辣椒CMS誘導表達的cDNA文庫中，篩選到 EST序列TA288，經(jīng)Blast比對分析表明，該片段與植物花器官發(fā)育AP3基因序列有較高的同源性，推測其為辣椒花器官發(fā)育MADS-box基因之一，進而設計特異引物序列進行3′、5′RACE擴增，分別獲得752 bp的3′端序列、625 bp的5′端序列。利用DNAMAN軟件去除2端載體序列和重疊部分，將2段序列進行拼接，得到長度為929 bp的基因全長序列，命名為PAP3（GenBank登錄號：HM104635）。用特異性引物在基因組DNA和cDNA上同時擴增PAP3基因，瓊脂糖跑膠結果顯示條帶完全相同，測序后分析序列完全相同（圖1）。

PAP3基因包含678 bp的開放閱讀框，編碼1個含226個氨基酸的蛋白質，推測的分子量為75.9 ku，推測的等電點為4.97。蛋白結構域分析表明，PAP3蛋白含有典型的MADS結構域（氨基酸序列第2～61位）和K結構域（氨基酸序列第86-176）2個保守結構域（圖2、圖3）。由此推測：PAP3基因應屬于MADS-box基因家族Ⅱ型基因。

2.2 PAP3氨基酸序列同源性比較與系統(tǒng)進化樹分析

由圖4可以看出，氨基酸序列的5′端保守性較高，而3′端保守性較低，這是MADS-box基因的典型特征。這6個序列是從NCBI上下載，并用DNAMAN軟件進行分析的，分別為番茄（NM_001247148）、矮牽牛（Q07472）、馬鈴薯（X67508）、曼陀羅（AEM60197）、風茄（DQ539405）、煙草（X96428）序列。

在擬南芥中與花發(fā)育相關的MADS-box基因分為5個亞族：AP1、AP3/PI、AG、AGL2和孤兒亞族。以擬南芥中的5個亞族作為對照，選取其中一些典型基因對PAP3基因進行系統(tǒng)進化樹分析，圖5結果表明，PAP3基因與擬南芥AP3

（NP_191002）基因聚為一類，屬于MADS-box基因家族中的AP3/PI亞族成員，為植物花器官發(fā)育B類功能基因。3 討論

與其他作物相比，在辣椒中大多數(shù)的MADS-box基因仍未被克隆及研究，本試驗通過RACE技術克隆了辣椒花器官發(fā)育相關的1個MADS-box基因PAP3。氨基酸序列分析和蛋白結構域分析表明，PAP3基因含有典型的MADS-box區(qū)域、K-box區(qū)域，N端的保守性高于C端。并且與番茄的TAP3 （NM_001247148）、擬南芥（NP191002）具有很高的序列同源性，因此屬于MADS-box基因家族。

系統(tǒng)樹分析表明，PAP3基因屬于MADS-box基因家族中的AP3/PI亞家族成員，為ABC花發(fā)育模型理論中的B功能基因，控制植物花瓣和雄蕊的發(fā)育[13-17]。與AP1亞家族相比，對AP3/PI亞家族的研究比較深入。在這個亞家族的進化過程中主要發(fā)生了2次基因重復事件。1次基因重復事件發(fā)生在現(xiàn)存的被子植物產(chǎn)生之前，產(chǎn)生了AP3/DEF、PI/GLO 這2個進化系；隨后，AP3/DEF進化系中又發(fā)生了1次基因重復事件，發(fā)生在核心真雙子葉植物基部，相似于 euAP1 重復的位置，結果產(chǎn)生TM6、euAP3進化系。在這個亞家族里，經(jīng)歷基因重復后，在擬南芥中產(chǎn)生了AP3、PI基因，金魚草中產(chǎn)生了DEF、GLO基因[18-20]。

本研究表明，PAP3基因屬于MADS-box基因家族中控制花瓣和雄蕊發(fā)育的B功能基因，今后可通過繼續(xù)深入研究PAP3基因的功能，最終為闡明辣椒花器官發(fā)育的分子調控機制奠定基礎。

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