干旱鹽堿共脅迫下玉米miR398的表達

張潔

摘要：分析干旱鹽堿共脅迫下玉米miR398的表達變化，闡明miR398與玉米水勢脅迫生理指標關系。干旱鹽堿共脅迫處理72 h，利用qRT-PCR技術分別驗證了miR398及其他對應的靶基因在鹽脅迫條件下的表達變化情況；應用ELISA和茚三銅方法分別檢測玉米的ABA （脫落酸）和脯氨酸含量。結果表明：經過干旱鹽堿共脅迫處理，玉米出現(xiàn)了明顯的水分虧缺癥狀，24、48、72 h各處理組玉米ABA和脯氨酸含量與對照組比較上升明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。說明干旱鹽堿共脅迫條件下玉米miR398表達下調，可能參與抗逆相關基因ABA的調控。試驗為后續(xù)抗旱抗鹽堿玉米遺傳性狀研究提供了基礎數(shù)據(jù)。

關鍵詞：玉米；干旱；鹽堿；miR398

中圖分類號： S513.032 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0045-03

玉米（Zea mays L.）是世界三大糧食作物之一，它的產量對世界糧食的供給有著重要的影響[1]。非生物因子中干旱是引起玉米減產的最為重要的脅迫因子[2]，干旱脅迫是植物逆境最普遍的形式，在許多地區(qū)是農業(yè)發(fā)展的瓶頸，每年全世界玉米產量損失中的幾乎一半是由干旱造成的。特別是在實際生產中干旱脅迫往往也伴隨著鹽堿的脅迫危害。統(tǒng)計現(xiàn)實表明，我國平均每年受旱面積0.22億hm2，成災面積0.09億hm2，直接減收糧食100億kg以上[3]。應用分子遺傳學方法研究作物抗旱抗鹽堿機制并通過基因工程培育新的作物品種已成為現(xiàn)代農業(yè)研究的重要目標。

Small RNA是一類非編碼的、能夠在轉錄水平和轉錄后水平調控基因表達的小分子RNA。最近的研究表明，植物在多種逆境脅迫下存在著miceo RNA（miRNA）的誘導表達并證實了某些miRNA在植物感受逆境脅迫而作出適應性調整的過程中發(fā)揮著重要的作用[4-5]。隨著研究的深入，miRNA將為我們闡明植物耐脅迫機理和提高植物耐脅迫能力提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑與儀器

玉米幼苗營養(yǎng)液培養(yǎng)所需試劑及藥品：液氮，Trizol（Invitrogen），三氯甲烷，異丙醇，無水乙醇，DEPC，無 RNA 酶雙蒸水。試劑盒：Reverse Transcription System（Promega），TaqMan RmicroRNA Reverse Transcription Kit （Applied Biosystems），SYBR Premmix Ex TaqTMⅡ （TaKaRa）。主要儀器：NANO 2000 紫外分光光度計（Thermo），普通 PCR 儀（伯樂），ABI 7300 熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems）。

1.2 方法

1.2.1 玉米處理和收集 試驗選用玉米品系YQ7-96，玉米種子催芽后待根長2～3 cm時，點種于營養(yǎng)盤中，用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，置于網室。處理組在三葉一心期（苗期，長度為 20 cm），每盆澆5 L含100 mmol/L混合鹽（50 mmol/L NaCl，50 mmol/L Na2SO4） 的Hoagland液作為鹽脅迫處理組和含 25 mmol/L NaHCO3、25 mmol/L Na2CO3的Hoagland液（pH值11，水勢為-0.7 MPa）作為堿共脅迫處理。0、24、48、72 h后分別取根莖和葉組織，立即用液氮冷凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆茫總€樣品取3次生物學重復。

1.2.2 總 RNA 提取 miRNA反轉錄莖環(huán)RT引物設計依據(jù)50 nt可自行折疊成莖環(huán)結構的寡核苷酸，序列如下：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACNNNNNN-3′，3′端的6個N代表與成熟miRNA 3′端反向互補的6個堿基。用于miRNA熒光定量的反向引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′，該引物實際上為RT引物上的一部分，對所有miRNA來說是通用的。正向引物利用Primer Express 3.0 （Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA） 設計，基礎序列為目標miRNA成熟序列，根據(jù)對引物的長度、Tm值及GC含量的要求再用軟件進行調整，可在5′端加2～3個GC以增加退火溫度，平衡GC含量。

1.2.3 miRNA反轉錄 利用TaqMan RmicroRNA Reverse Transcription Kit （Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）試劑盒反轉錄miRNA，內參選擇18S rRNA。

1.2.4 miRNA 熒光定量PCR 利用ABI 7300 Sequence Detection System （Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）熒光定量PCR儀進行miRNA熒光定量PCR反應。熒光定量PCR試劑盒采用TaKaRa公司的SYBR Premmix ExTaqTMⅡ，并以18S rRNA 作為內參對照，miR398a引物序列如下：5′-ATTCGCACTGGATACGACCGGGGG-3′，5′-GCCGCTGTGTTCTCAGGTC-3′，退火溫度為58 ℃。

1.2.5 脫落酸（ABA）的含量 ABA含量測定方法依據(jù)中國農業(yè)大學的ELISA試劑盒說明書，并參考酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定內源植物激素。

1.2.6 脯氨酸的含量 脯氨酸含量測定方法是依據(jù)茚三酮比色法[6]。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 PCR反應結束后，手動設置合適的閾值，之后導出CT值數(shù)據(jù)，利用ΔΔCT法衡量miRNA及其靶基因在不同樣品中的差異表達水平。對于特定時間點的處理樣品，有以下表達式：

ΔΔCT=（CT，miRNA干旱鹽堿處理組-CT，18S rRNA，干旱鹽堿處理組）-（CT，miRNA，對照組-CT，18S rRNA，對照組）。

統(tǒng)計分析采用Stata統(tǒng)計分析軟件，比較各試驗組與對照組間的差異。

2 結果與分析

2.1 非生物脅迫處理的玉米和正常條件下玉米

玉米種子經過催芽后盆栽于溫室中。待苗生長至雌雄分化盛期（大喇叭口期，約12張真葉），觀察玉米生長情況，以保證玉米生長良好且均一，無明顯形態(tài)差異，此時將玉米材料分為處理組和對照組。48 h后，對照組玉米葉片舒展生長良好；處理組玉米葉片卷蔫，且有黃葉出現(xiàn)，表現(xiàn)為典型的水分虧缺癥狀（圖1）。

2.2 在干旱和鹽堿共脅迫條件下玉米miR398表達模式

熔解曲線可用來衡量引物質量的好壞，較好的引物具有較高的擴增效率，不會形成引物二聚體或產生錯配。可從曲線形狀看出miR398和內參（18S rRNA）PCR擴增過程熔解曲線呈現(xiàn)“S”形（圖2），這表明PCR擴增試驗進行良好。

為了進一步探索miRNA在鹽脅迫條件下的表達變化情況，利用 qRT-PCR 技術檢測玉米miR398b在干旱鹽堿共脅迫條件下（0、24、48、72 h）變化情況。圖3結果顯示，24、48、72 h的處理組miR398表達量與對照組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P

2.3 干旱鹽堿共脅迫下玉米脫落酸和脯氨酸含量的變化

在干旱鹽堿共脅迫處理后，通過ELISA技術測定對照和處理2組玉米幼苗樣品的細胞內源ABA、脯氨酸含量。圖4結果表明，與對照組相比，24、48、72 h的處理組玉米脫落酸累積量與對照組相比明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P

3 討論

植物中的小RNA在植物的生長發(fā)育、組織器官的形態(tài)建成、逆境應答和信號轉導等過程中發(fā)揮重要的調控作用。通過對靶基因預測和功能分析后發(fā)現(xiàn)，某些脅迫（旱、鹽堿、熱、冷、凍）誘導的miRNA還直接參與植物逆境脅迫下的適應性反應。尤其是miRNA在植物非生物環(huán)境脅迫應答中的調控作用日益受到重視[7]。miRNA389可以同時受這4種非生物因素脅迫的調控。在轉基因擬南芥中研究進一步揭示miRNA398在調控CSD2基因表達中和氧化脅迫中的重要作用。而干旱、嚴寒和鹽分則會影響植物 miR319c、miR393、miR395、miR397b和miR402 的表達水平[8]。實際上，Sunkar等構建了擬南芥幼苗經脫水、高鹽、低溫和ABA脅迫處理后的小分子RNA文庫并對文庫的測序結果進行分析，發(fā)現(xiàn)了26個新的miRNAs，它們來源于15個新的miRNA家族[9]。但是，miRNA在植物抗逆反應中作用的分子機制目前還不清楚，有待進一步研究。

氧化應激反應是玉米在多種逆境脅迫環(huán)境下的生理反應，氧化應激反應可導致玉米體內脯氨酸的含量顯著增加。植物體內脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強的品種往往積累較多的脯氨酸。因此測定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的生理指標。同時，在玉米葉片中ABA誘導產生的H2O2能通過促發(fā)促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）引起的級聯(lián)反應來調節(jié)一些抗氧化酶類基因的表達，進一步增強抗氧化酶類的活性，最終啟動氧化防御系統(tǒng)[10]。本試驗結果顯示，miR398在干旱鹽堿脅迫過程中參與靶基因ABA和脯氨酸的抗氧化防御機制的調控。因此我們認為：miR398可以通過增加ABA的累積，進而激活ABA誘導的抗氧化防御系統(tǒng)，且此過程還涉及到脯氨酸。

試驗過程中玉米鹽堿處理濃度是獲得相關基因表達的重要因素。目前，國內外對玉米耐鹽堿性鑒定還沒有形成統(tǒng)一的、權威的耐鹽堿鑒定濃度，大部分研究者都是根據(jù)自身的鑒定方法、處理溶液選取不同的鑒定濃度，而且在操作過程中的誤差或人為因素都有可能造成鑒定濃度的不同[11-13]。因此，本試驗中對耐鹽堿性鑒定濃度的篩選是很必要的。本研究最終確定的玉米苗期鹽性處理濃度為100 mmol/L，確定的玉米苗期堿處理濃度為35 mmol/L；劉芳等研究表明，NaCl濃度為 250 mmol/L 是玉米苗期耐鹽性篩選的理想濃度[14]；崔美燕的研究表明，Na2CO3濃度為25 mmol/L可以作為玉米苗期耐堿性鑒定的理想濃度[15]。另外，玉米在苗期的耐鹽堿性很重要，因為植株苗期的生長情況影響其最終的產量。本試驗是在選取玉米對鹽堿脅迫最敏感的“3葉1心”期進行鹽堿脅迫處理3 d。

本試驗中使用的耐鹽堿性鑒定濃度與其他人的研究存在一定的差異，并使用較重的脅迫參數(shù)。這樣更有利于獲得特異性相關miRNA表達。此外，崔美燕等采用苗情評價的方法對玉米自交系幼苗進行耐鹽、堿性鑒定，根據(jù)鹽或堿脅迫處理 7 d 后苗情觀察來評價玉米材料的耐鹽、堿性性狀，非常直觀、簡單[15-16]。為了檢測玉米對干旱鹽堿脅迫的早期反應，在試驗中收集處理3 d后的玉米混合組織作為抽提RNA的材料。

本研究建立了鹽、堿和旱共脅迫下的玉米品系YQ7-96模型，檢測miR398在不同處理時期的表達水平，并驗證miR398表達與多個玉米抗旱指標（ABA和脯氨酸）的相關性。研究發(fā)現(xiàn)，在玉米幼苗植株中miR398表達在干旱鹽堿共處理后被抑制，而基因ABA和脯氨酸在處理組的玉米葉片中也被大量誘導表達。試驗將初步闡明由miRNA介導的玉米幼苗干旱脅迫響應機制的調控網絡，為更好地理解植物耐旱分子機理提供試驗數(shù)據(jù)。

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