喙尾琵琶甲化學防御物質氣相色譜—質譜分析及抑菌試驗

郭明磊 劉建宏

摘要：對喙尾琵琶甲（Blaps rynchopetera Fairmai）化學防御物質的抑菌作用進行了研究。結果表明，喙尾琵琶甲化學防御物質能夠抑制細菌的生長，且對革蘭氏陽性菌的抑制效果好于革蘭氏陰性菌；用二氯甲烷萃取喙尾琵琶甲化學防御物質，經過氣相色譜—質譜分析，共鑒定出25種化合物，占總量的90.15%，其最主要成分是2-乙基-2，5-環己二烯-1，4-二酮、二十二碳烯酰胺、十八碳烯酰胺、十三碳烯、2-甲基-2，5-環己二烯-1，4-二酮。

關鍵詞：喙尾琵琶甲（Blaps rynchopetera Fairmai）；化學防御物質；抑菌試驗；氣相色譜—質譜分析

中圖分類號：S718.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）05-1271-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.046

GC-MS and Antibiotic Activity of Chemical Defense Substances of Blaps Rynchopetera

GUO Ming-lei， LIU Jiang-hong

（College of Forestry， Southwest Forestry University， Kunming 650224， China）

Abstract： This experiment was aimed to study the antibiotic effect of the chemical defense substances from Blaps rynchopetera. The results showed that the defensive chemicals could inhibit the growth of bacteria， and the effects on gram positive bacteria were better than on gram negative bacteria. The chemical defense substances were extracted by dichloromethane and identified by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. The identified chemical compositions were about 90.15 percent of the total Blaps rynchopetera weight and contained 25 kinds of compounds， such as 2-methyl-2，5-cyclohexadiene-1，4-dione， docosene amide， octadecenoic amide， tridecene， 2-ethyl-2，5-cyclohexadiene-1，4-dione etc.

Key words： Blaps rynchopetera Fairmai； chemical defense substances； anti-bacteria test； GC-MS

昆蟲為了適應環境，呈現出多種防御方式，其中化學防御是昆蟲最為有效的防御方式，它在昆蟲防御行為中起決定性作用[1]。昆蟲的化學防御，是指當昆蟲受到驚擾或遇到天敵傷害時，就放出氣體或臭味使天敵避開，或者用毒針螯刺天敵的防御行為；化學防御物質主要由食物成分合成；昆蟲的化學防御物質主要有烷烴類、烯類、醛類、酮類、酸類、胺類、萜類、脂類、醌類、甾類等組成的混合物[2，3]。

喙尾琵琶甲（Blaps rynchopetera Fairmai），屬鞘翅目（Coleopter）、擬步甲（Tenebrionida）、琵琶甲屬（Blaps）昆蟲，主要分布在云南、貴州和四川，其中云南的分布最為集中[4]。在云南民間，人們主要用來抗菌消炎和抗癌等。目前，國內學者對喙尾琵琶甲的研究主要集中在其藥理作用（即抑菌活性）和化學成分的研究方面[5-8]。本研究用氣相色譜—質譜分析喙尾琵琶甲化學防御物質的化學成分，并研究化學防御物質的抑菌活性，對喙尾琵琶甲化學防御機理進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用喙尾琵琶甲成蟲均購自云南省昆明金鑫花鳥市場。

1.2 供試菌種

供試菌為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureu）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠桿菌（Pseudomonas aeruginosa）；前兩種為革蘭氏陽性菌，后兩種為革蘭氏陰性菌。4種細菌均由西南林業大學王芳老師提供。

1.3 儀器

美國Agilent Technologies公司HP6890GC/5973MS氣相色譜-質譜聯用儀。

1.4 研究方法

1.4.1 化學防御物質收集 方法參考劉勇等[5]、李偉等[9]的方法。將1.5 mL離心管放置于喙尾琵琶甲成蟲腹部末端，給予物理刺激，收集臀腺分泌物。每管收集原液大約200 μL，加入100 μL二氯甲烷溶液，10 000 r/min高速離心10 min。離心后，分為上層水相和下層有機相，將二者分離，放于-20 ℃保存備用。

1.4.2 抑菌試驗 將活化好的4種細菌，分別接種到10 mL的NA培養基中，37 ℃過夜培養。將培養好的菌液200 μL均勻涂布在NA培養基平板上待用。將經過滅菌、烘干的直徑大小為5 mm的濾紙片浸泡在收集的分泌物上下層中，然后再將濾紙片放入到已經涂好菌液NA培養基中，37 ℃恒溫箱中過夜培養，觀察結果，重復3次。對照組分別為二氯甲烷和蒸餾水。

1.4.3 氣相色譜—質譜分析 將收集的分泌物有機相進行氣相色譜—質譜分析。氣相色譜條件：HP-5MS石英毛細管柱（30 mm×0.25 mm×0.25 mm）；柱溫：起始溫度40 ℃，程序升溫3 ℃/min至80 ℃，再程序升溫5 ℃/min 至260 ℃ ；柱流量為1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；柱前壓100 kPa；進樣量1.0 mL；分流比10∶1；載氣為高純氦氣。質譜條件：電離方式EI；電子能量70；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質量范圍35-500；采用Wiley7n.l標準譜庫檢索定性。

2 結果與分析

2.1 防御物質的抑菌性

由圖1可知，喙尾琵琶甲化學防御分泌物下層有機相對細菌具有良好的抑制效果，而上層水相沒有抑制效果，對照組蒸餾水以及二氯甲烷均無抑菌效果。由表1可知，化學防御分泌物對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌和銅綠桿菌抑菌直徑分別為17.96、21.86、15.50和8.96 mm，對4種細菌的抑制效果依次為枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠桿菌，其中，對枯草桿菌顯著優于其余3種細菌；化學防御分泌物對革蘭氏陽性菌的抑制效果好于革蘭氏陰性菌。

2.2 氣相色譜—質譜分析結果

由表2可知，喙尾琵琶甲的防御物質主要成分有2-乙基-2，5-環己二烯-1，4-二酮、二十二碳烯酰胺、2-甲基-2，5-環己二烯-1，4-二酮、十八碳烯酰胺、十三碳烯，分別占總含量的21.14%、17.58%、11.29%、9.84%、8.10%，這5種化合物共占總物質的67.95%，其余20種化合物僅占總物質的22.20%。所鑒定的成分中，可將其分成苯醌類、苯酚類、烷類以及胺類，這四類物質共占81.75%。醌類化合物包括2-甲基-2，5-環己二烯-1，4-二酮、2，5-環己二烯-1，4-二酮、2-乙基-2，5-環己二烯-1，4-二酮，占34.00%；苯酚類包括1，4-苯二酚、2-甲基-1，4-苯二酚、4-乙基-1，3-苯二酚，占5.41%；烷類包括C12、C17、C19、C21、C25～C31烷，占8.44%；胺類包括十六酰胺、十八碳烯酰胺、十八酰胺、二十二碳烯酰胺，占33.90%。

3 討論

3.1 萃取劑的選取

強承魁等[10]采用二氯甲烷、正己烷以及乙酸乙酯作為溶劑提取黃粉蟲（Tenebrio molitor）的防御分泌物，發現采用二氯甲烷的效果最好。同樣，國外學者Rossini等[11]、Eisner等[12]和Farine等[13]也曾采用二氯甲烷作為溶劑，提取Therea petiveriana、步行蟲（Galerita lecontei）和炮甲（Metrius contractus）的化學防御物質。因此，本項研究中采用二氯甲烷為喙尾琵琶甲防御物質的萃取劑。由于喙尾琵琶甲防御分泌物分泌量少，不易收集，本研究采用濾紙片對其抑制細菌生長進行定性試驗，并沒有對其進行定量試驗。

3.2 抑菌試驗討論

在本研究中，喙尾琵琶甲化學防御物質對于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都均有抑制作用，且對革蘭氏陽性菌效果更佳，這與劉勇等[5]、羅建蓉等[8]以及施貴榮等[14]的結果保持一致。

在本研究中，喙尾琵琶甲化學防御物質主要成分2-乙基-2，5-環己二烯-1，4-二酮、二十二碳烯酰胺、2-甲基-2，5-環己二烯-1，4-二酮、十八碳烯酰胺、十三碳烯。其中2-甲基-2，5-環己二烯-1，4-二酮和2，5-環己二烯-1，4-二酮、2-乙基-2，5-環己二烯-1，4-二酮均是昆蟲典型的苯醌類防衛化合物，具有較大的毒性，檀東飛等[15]用1，4-苯醌（即2，5-環己二烯-1，4-二酮）對大腸桿菌、枯草桿菌、藤黃八疊球菌3種細菌的抑菌效果進行觀察，發現1，4-苯醌能夠完全抑制供試菌種。其抗菌功能可能是由于苯醌在細菌的細胞內與DNA、蛋白質交互作用，形成共價化合物同時產生了活性氧，造成基因突變和蛋白質變性，最終導致了細胞死亡[16，17]

3.3 防御物質化學成分

Pescke等[18]報道琵琶甲（Blaps mucronata）防御性分泌物中含有13個碳原子的烴；劉勇等[5]在報道了云南琵琶甲防御物分泌物主要成分1，4-苯醌、2-乙基-1，4-苯醌、2-甲基-1，4-苯醌、1-十三烯和（E）-5-十八烯、乙基苯、1，3-二甲基苯、十烷、十一烷、十二烷；強承魁等[10]對黃粉蟲所分泌出的化合物物質中的正二十三烷、2-甲基對苯醌、12-二十五烯、對甲酚、正二十四烷、正二十五烷和正二十六烷進行了報道。本研究中喙尾琵琶甲化學防御物質主要成分有苯醌類、苯酚類、烷類以及胺類，如2-乙基-2，5-環己二烯-1，4-二酮、2-甲基-2，5-環己二烯-1，4-二酮、1，4-苯二酚、十三碳烯、二十二碳烯酰胺、十八碳烯酰胺以及長鏈烷，這與上述結果基本一致。

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