功能基因在皮膚微生物群落分析中的應(yīng)用*

姚雪，李輝，張凱鑫，周懷谷，羅亞平△

(1.中國(guó)人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100038；2.上海市刑事科學(xué)技術(shù)研究院，上海 200083)

1 引 言

人類皮膚微生物組指所有在人類皮膚上的微小生物，如細(xì)菌、真菌和病毒等[1]。針對(duì)細(xì)菌的分析主要是基于16S rRNA基因的測(cè)序結(jié)果，而這種分析方法存在一定的劣勢(shì)。首先，該基因并非單拷貝基因，因此，其測(cè)序結(jié)果總體上來(lái)說(shuō)僅僅是半定量的[2]，會(huì)影響微生物群落的α多樣性及β多樣性的測(cè)度時(shí)，導(dǎo)致分析結(jié)果與實(shí)際情況間存在偏差；其次，16S rRNA基因的可變區(qū)變異程度不夠大，在區(qū)分同一屬內(nèi)不同種時(shí)存在困難。已有的研究顯示，與宏基因組shotgun測(cè)序相比，實(shí)驗(yàn)16S rRNA基因的V1-V3區(qū)測(cè)序獲得的微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與之相似，而V4區(qū)測(cè)序獲得的微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果卻不盡人意[3]。為了彌補(bǔ)16S rRNA基因存在的這些問(wèn)題，開(kāi)發(fā)新的管家基因引物是必需的。

在綜合分析人類皮膚微生物群落組成的文獻(xiàn)[4-6]的基礎(chǔ)上，選擇了4個(gè)最為普遍存在的屬的細(xì)菌，從NCBI的Genome數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了這四個(gè)屬60種細(xì)菌的全基因組并對(duì)其進(jìn)行了分析，具體包括：Corynebacterium屬24種細(xì)菌，Lactobacillus屬12種細(xì)菌，Staphylococcus屬8種細(xì)菌，Streptococcus屬16種細(xì)菌。在對(duì)這些屬的基因組分析的基礎(chǔ)上，篩選出一些普遍存在的單拷貝功能基因[7]，并針對(duì)其保守區(qū)域設(shè)計(jì)了一些具有通用擴(kuò)增能力的引物。將這些引物成功地應(yīng)用在分析不同年齡階段、不同性別的36名志愿者的皮膚微生物群落結(jié)構(gòu)特征分析上。結(jié)果證明這些新設(shè)計(jì)的引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果經(jīng)分析，能夠成功將細(xì)菌鑒定到種，在分析皮膚微生物群落方向具有良好的應(yīng)用前景。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1供試樣品 試驗(yàn)樣品采集自36名志愿者的雙手手掌面，所有志愿者按年齡不同分為3個(gè)組別(15至24歲；25至34歲；35歲及以上)，每個(gè)組別中男女?dāng)?shù)目各半。

2.1.2主要試劑及儀器 High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche Diagnostics GMbH，德國(guó))，Q5 HighFidelity 2X Master Mix，(New England Biolabs，美國(guó))，JY88-II DN 超聲波信號(hào)發(fā)生器(南京新辰生物科技有限公司，中國(guó))，Gene Amp PCR System 9700(Applied Biosystems，美國(guó))，Hiseq 2500測(cè)序儀(Illumina，美國(guó))。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1樣品采集及DNA提取 使用尖頭棉簽蘸取0.1% Tween 20+0.15M NaCl，在志愿者手掌面上反復(fù)擦拭，將棉簽頭部剪入1.5 ml離心管中(含500 μL 0.1% Tween 20+0.15 M NaCl)，渦旋震蕩2 min。超聲處理5 min(超聲2 s，間隔3 s，功率18%)后使用Roche High Pure PCR Template Preparation Kit試劑盒提取DNA，最終使用100 μL ddH2O溶解DNA。(樣品編號(hào)中L、R分別表示左手、右手，1、2、3、4、5、6、7、8等數(shù)字分別表示志愿者編號(hào)。)

2.2.2PCR擴(kuò)增 PCR體系均為50μL體系：Q5 High-Fidelity 2X Master Mix 25 μL，上下游引物(每個(gè)處理所用引物均在5’端帶有4bp barcode，引物濃度為10pMol)各1μL，溶解有DNA的ddH2O 23 μL。

rpsL基因引物對(duì)序列為rpslf (5’-ATGCCAACCATTAACCAATT-3’)(正向引物)， rpslr (5’-GCAGTATCAAGGGCACCACG-3’)(反向引物)。PCR條件：預(yù)變性95℃ 5 min；變性95℃ 30 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 30 s(35個(gè)循環(huán))；延伸7 min。

rpsH基因引物對(duì)序列為rpshf (5’-ATGGCTATGACTGATCCAAT-3’)(正向引物)，rpshr (5’-TTACCAAACGTAGGCAATTACTTC-3’)(反向引物)。PCR條件：預(yù)變性95℃ 5 min；變性95℃ 30 s，退火50℃ 30 s，延伸72℃ 30 s(35個(gè)循環(huán))；延伸7 min。

dnaK基因引物對(duì)序列為dnakf (5’-TACTTCAACGATGCTCAACGTCAAGC-3’)(正向引物)，dnakr (5’-TCCTTCTTAGCCTTTTCAGCAGCATC-3’)(反向引物)。PCR條件：預(yù)變性95℃ 5 min；變性95℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 30 s(35個(gè)循環(huán))；延伸7 min。

16S rRNA基因引物序列為F27(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)(正向引物)，R338(5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’)(反向引物)。PCR條件：預(yù)變性95℃ 5 min；變性95℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 30 s(35個(gè)循環(huán))；延伸7 min。

2.2.3測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 PCR產(chǎn)物使用Illumina Hiseq 2 500測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用QIIME 1.8.0軟件分析[8]。選擇質(zhì)量>20且長(zhǎng)度>200 bp的序列進(jìn)行分析，先用FLASH軟件根據(jù)overlap將雙端序列合并成單端序列，得到完整的基因目標(biāo)區(qū)域序列，然后根據(jù)barcode及引物進(jìn)行分樣，將測(cè)序數(shù)目少于1 000條的樣品排除，不參與后續(xù)的分析運(yùn)算；分樣后使用QIIME 1.8.0軟件包中的pick_otu.py中的uclust方法進(jìn)行OTU聚類，之后在每個(gè)OTU中挑選一條代表序列，用blastx與對(duì)應(yīng)功能基因的蛋白序列庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到每個(gè)代表序列的物種信息，也就得到了對(duì)應(yīng)的OTU的物種信息；根據(jù)每個(gè)OTU包含的序列數(shù)及對(duì)應(yīng)的物種信息，可以計(jì)算出每個(gè)物種的豐度，并通過(guò)序列抽樣的方法得到相關(guān)多樣性指數(shù)的稀疏曲線(α多樣性分析)，通過(guò)計(jì)算樣品間的距離(功能基因使用bray-curtis距離，16S rRNA基因使用weighted UniFrac 距離)，對(duì)所有樣品進(jìn)行β多樣性分析。

3 結(jié)果和分析

3.1 rpsH基因片段分析手掌面皮膚表面微生物群落

質(zhì)量篩選后共得到871,953條序列(來(lái)自39只手掌面的皮膚)，均一化后每個(gè)樣品得到的OTU數(shù)目在61種至198種之間，含量最高的四個(gè)種分別是Streptococcus mitis，Lactobacillus crispatus，Abiotrophia defectiva 及 Streptococcus salivarius。由α多樣性指數(shù)計(jì)算結(jié)果可見(jiàn)，參與實(shí)驗(yàn)的志愿者手掌面皮膚表面微生物群落的shannon指數(shù)在1.779到5.341之間，simpson指數(shù)在0.363到0.936之間。不同樣品物種豐度聚類熱圖見(jiàn)圖1，不同樣品間的UPGMA建樹(shù)見(jiàn)圖2。

圖1 不同樣品物種豐度聚類熱圖(rpsH gene)

圖2 不同樣品間基于bray-curtis距離的UPGMA建樹(shù)(rpsH gene)

3.2 rpsL基因片段分析手掌面皮膚表面微生物群落

質(zhì)量篩選后共得到11,879,298條序列(來(lái)自62只手掌面的皮膚)，均一化后每個(gè)樣品得到的OTU數(shù)目在104種至632種之間，含量最高的四個(gè)種分別是Staphylococcus epidermidis，Streptococcus pneumoniae，Staphylococcus capitis及Staphylococcus hominis。由α多樣性指數(shù)計(jì)算結(jié)果可見(jiàn)，參與實(shí)驗(yàn)的志愿者手掌面皮膚表面微生物群落的shannon指數(shù)在2.078到5.602之間，simpson指數(shù)在0.424到0.929之間。不同樣品物種豐度聚類熱圖見(jiàn)圖3，不同樣品間的UPGMA建樹(shù)見(jiàn)圖4。

圖3 不同樣品物種豐度聚類熱圖(rpsL gene)

圖4 不同樣品間基于bray-curtis距離的UPGMA建樹(shù) (rpsL gene)

3.3 dnaK基因片段分析手掌面皮膚表面微生物群落

質(zhì)量篩選后共得到6,633,964條序列(來(lái)自54只手掌面的皮膚)，均一化后每個(gè)樣品得到的OTU數(shù)目在39種至305種之間，含量最高的四個(gè)種分別是Prevotella sp. oral taxon 473， Bacillus subtilis，Streptococcus pneumoniae及Streptococcus sanguinis。由α多樣性指數(shù)計(jì)算結(jié)果可見(jiàn)，參與實(shí)驗(yàn)的志愿者手掌面皮膚表面微生物群落的shannon指數(shù)在2.219到7.540之間，simpson指數(shù)在0.431 到0.983之間。不同樣品物種豐度聚類熱圖見(jiàn)圖5，不同樣品間的UPGMA建樹(shù)見(jiàn)圖6。

圖5 不同樣品物種豐度聚類熱圖(dnaK gene)

圖6 不同樣品間基于bray-curtis距離的UPGMA建樹(shù)(dnaK gene)

圖7 不同樣品物種豐度聚類熱圖(16S rRNAgene)

圖8 不同樣品間基于bray-curtis距離的UPGMA建樹(shù)(16S rRNAgene)

3.4 16S rRNA基因片段分析手掌面皮膚表面微生物群落

質(zhì)量篩選后共得到3,292,545條序列(來(lái)自48只手掌面的皮膚)，均一化后每個(gè)樣品得到的OTU數(shù)目在120 種到 251種之間，含量最高的四個(gè)屬分別是Propionibacterium, Corynebacterium，Staphylococcus和Paracoccus。由α多樣性指數(shù)計(jì)算結(jié)果可見(jiàn)，參與實(shí)驗(yàn)的志愿者手掌面皮膚表面微生物群落的shannon指數(shù)在 4.016 到 6.992之間，simpson指數(shù)在0.794 到 0.980之間。不同樣品物種豐度聚類熱圖見(jiàn)圖7，不同樣品間的UPGMA建樹(shù)見(jiàn)圖8。

4 討論

由16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)得出的所有樣品中含量最高的細(xì)菌分別是Propionibacterium，Corynebacterium和Staphylococcus等，該結(jié)論與Leung等人的研究結(jié)果相一致[4]。由其他三個(gè)功能基因的測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)得出的含量較高的細(xì)菌的種類的結(jié)果存在差異，主要原因是不同的引物對(duì)針對(duì)不同的種屬其擴(kuò)增能力存在差異造成。雖然這些新設(shè)計(jì)的引物對(duì)的通用擴(kuò)增能力不及16S rRNA基因的引物，但其鑒定能力更強(qiáng)，不僅能夠?qū)⒓?xì)菌準(zhǔn)確地鑒定到種這一層級(jí)，而且也能實(shí)現(xiàn)對(duì)不同樣品間的微生物群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行比較。所以這些新設(shè)計(jì)的引物在皮膚微生物群落的分析中有較好的應(yīng)用前景。