AMPK信號通路調控的自噬在七氟烷后處理保護大鼠心肌缺血再灌注損傷中的機制研究*

覃琴，王琛，喬世剛，周迅

(蘇州大學附屬第二醫院麻醉科，蘇州 215004)

1 引 言

缺血性心肌病具有高發病率和高死亡率的特點，是世界常見的死亡原因之一。有效及時地恢復冠狀動脈血流是減少心肌梗死，提高患者存活率的有效途徑。然而再灌注會導致心臟出現嚴重的心率失常、收縮舒張功能障礙以及心肌梗死范圍增加等一系列并發癥[1-2]。已證實吸入麻醉藥預處理與后處理能減少心肌缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion, I/R)損傷[3-4]。2003年Kemp BE首次報道腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是哺乳動物體內一個復雜的異源性三聚體結構，一直被作為一個“細胞內燃料計”或“能量調節器”而被人們所關注。近來研究表明，AMPK的激活在調節機體氧化應激、KATP通道、細胞增值和死亡中均發揮重要作用[5-6]，這些機制可能與AMPK激活后發揮I/R心肌保護作用有關。并且AMPK作為調節細胞內自噬/溶酶體途徑的上游信號通路，一直以來都是人們關注的熱點[7-9]。我們在前期研究的基礎上，通過給予AMPK激活抑制劑Compound C,觀察心肌損傷程度和檢測p-AMPK/t-AMPK蛋白表達及其通路下游自噬相關蛋白表達變化，進一步探討七氟烷后處理產生的心肌保護機制。

2 材料與方法

2.1 動物I/R模型建立及分組

健康雄性成年SD大鼠50只，質量270～320 g，SPF級，由昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司提供，許可證編號[scxk(蘇)2014-0006]。所有的實驗操作均經蘇州大學實驗動物使用及保護委員會許可。

50只大鼠建立在體心肌I/R模型，戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔內注射麻醉大鼠后，于右側頸內靜脈及頸內動脈置入充滿肝素的導管，用于靜脈給藥、動脈血氣分析或監測動脈血壓。氣管切開并插入氣管導管，連接ALC-V9動物呼吸機，行呼氣末正壓通氣，吸入氧濃度33%，調節呼吸頻率或潮氣量，維持pH 7.35～7.45、PaCO2 25～40 mmHg、PaO2 90～150 mmHg (1mmHg=0.133KPa)。采用智能恒溫控制儀維持大鼠體溫在36 ℃～37 ℃。于大鼠第5肋間行左胸切開術，打開心包，6～0無損傷縫合線在左心耳下緣結扎左冠狀動脈前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)，縫線末端穿入自制圈套管，平衡30 min。用止血鉗夾緊圈套管以阻斷LAD血供，若心外膜發紺蒼白，心電圖示一過性心律失常，ST段弓背向上抬高表示缺血模型成功；松開圈套管進行再灌注，可見心外膜重新充血證明再灌注成功[10]，大鼠因再灌注期頻發心律失常刪除。

I/R模型建立成功后，隨機將50大鼠分為5組：對照組(Sham組)，不缺血維持5 h；I/R組，平衡30 min，缺血30 min，再灌注4 h；七氟烷后處理組(SP組)，平衡30 min，缺血30 min，在缺血27 min時，給予大鼠吸入2.5%七氟醚(批號：H20130816，Maruishi Pharmaceutical公司，日本)3 min，再灌注開始后2 min繼續吸入七氟醚后停止，共5 min；DMSO組，平衡30 min，缺血30 min，再灌注開始后靜脈給予等量的Compound c溶劑二甲亞砜(DMSO)，再灌注4 h； Compound c組(Com c組)，平衡30 min，缺血30 min，再灌注開始后靜脈給予AMPK抑制劑Compound c 250 g/kg[11]，再灌注4 h。通過生物信號采集處理系統連續監測并記錄各組大鼠平衡15、缺血15 min、再灌注1、2和4 h等時間點心率、平均動脈壓(MAP)和心率-收縮壓乘積(rate-pressure product, RPP)。

2.2 TTC法測定心肌梗死范圍

大鼠心肌再灌注4 h時，再次阻斷LAD，頸內靜脈注射5%伊文思藍1 ml使左心室正常區域藍染，迅速取出心臟分離出左心室，用干冰速凍5 min,使用大鼠心臟切片器橫斷分割成6塊2 mm厚的組織塊。將左心室中藍染的正常組織與未染色的左心室缺血區組織分離。采用TTC染色法，將心肌組織放入1% TTC中，置于37℃恒溫水浴箱15 min，4%多聚甲醛過夜以固定組織。立式顯微鏡下將左心室分成正常(藍染區域)、缺血未梗死區(TTC染色后紅色區域)和缺血梗死區(TTC染色后灰白色區域)3部分，并分別用電子天平稱重，計算缺血區心肌質量(缺血未梗死區心肌質量+梗死區心肌質量)占左心室心肌質量的百分比、缺血梗死區心肌質量占缺血區心肌質量的百分比，心肌梗死范圍以梗死區心肌質量占缺血區心肌質量的百分比表示[10]。

2.3 Western Blot法測定p-AMPK/t-AMPK、LC3、P62蛋白表達

隨機將30大鼠分為5組，每組6只。再灌注4 h迅速取下心臟，-80 ℃液氮冷凍保存。取約300 mg左心室心尖部組織，剪碎，置于勻漿器最底部，加入Western細胞裂解液，蛋白酶抑制劑(PMSF)和磷酸酶抑制劑(PST)，低溫下超聲細胞破碎儀裂解3次。裂解后，低溫下靜置半小時，將裂解后的組織勻漿移至1.5 ml EP管中，將EP管放入離心機中，4℃下1 500 g離心30 min，取上清分裝于1.5 ml離心管中，并于低溫冰箱中保存。所有操作均必須在冰面進行。運用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定提取的蛋白樣品的濃度，并用裂解液將其調至相同蛋白濃度。在樣品中加入上樣緩沖液混勻，95 ℃煮5 min，使蛋白質充分變性，并于低溫冰箱中凍存。BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0010S，碧云天生物技術研究所)測定蛋白樣品的蛋白含量，并用裂解液調至相同濃度值，97 ℃金屬浴持續加熱5 min。每個樣品取20 μg蛋白于12%聚丙烯酰胺凝膠(BIO-RAD公司，美國)分離蛋白，電泳完畢轉至硝酸纖維素膜(Millipore公司，美國)，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入一抗p-AMPK(1∶1000，批號：2535，Cell Signaling公司，美國)、一抗LC3(1∶1000，批號：136F3，Santa Cruz公司，美國)、一抗P62(1∶1000，批號：8G10，Santa Cruz公司，美國)、內參GAPDH(1:1000，批號：AG019，碧云天生物技術研究所)，4℃一抗孵育過夜。TBST溶液漂洗3遍后加入二抗搖床孵育2 h。采用ECL試劑盒(批號：34077，Thermo公司，美國)顯色；最后進行增強化學發光反應，將PVDF膜放入發光液(免疫印跡化學發光試劑AB液，批號：0609*025，Merck公司，德國)中，移置暗室，曝光后自動洗片機顯影，定影。采用Image軟件測定條帶灰度值，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值反映心肌組織p-AMPK/t-AMPK、LC3、P62蛋白表達水平。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 各組血流動力學指標比較

平衡15min，各組間心率、MAP和RPP比較差別無統計學意義(P>0.05)。在缺血期和再灌注期，除Sham組外，其余各組MAP和RPP較平衡期下降(P<0.05)；與SP組比較，DMSO組差別均無統計學意義(P>0.05)，I/R組和Com c組MAP和RPP下降(P<0.05)。各組再灌注期間大鼠死亡率無統計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠血流動力學變化的比較

注：與平衡期比較，P<0.05；與I/R組比較，P<0.05;與SP組比較，P<0.05

3.2 各組心肌梗死范圍比較

各組心肌缺血區域所占比例比較無明顯差異(P>0.05)。與I/R組(55.2±11.6%)比較，SP組(36.8±17.2%)心肌梗死范圍減少(P<0.05)；與SP組比較，Com c組(56.6 ± 13.2%)梗死范圍增大(P<0.05)；SP組和DMSO組比較差異無統計學意義(P>0.05)(見表2，圖1)。

3.3 Western Blot檢測結果

與I/R組比較，SP組和DMSO組p-AMPK/t-AMPK蛋白表達上調而LC3 Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表達下調(P<0.05)；與SP組比較，Com c組p-AMPK/t-AMPK蛋白表達下調而LC3 Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表達上調(P<0.05)(見圖2、圖4)。

表2 各組缺血再灌注心肌各部分質量及比值

注：與Sham組比較，aP<0.05，bP<0.01；與I/R組比較，cP<0.05；與SP組比較，eP<0.05

與Sham組比較，bP<0.01；與I/R組比較，dP<0.01；與SP組比較，fP<0.01

與Sham組比較，aP<0.05，bP<0.01；與I/R組比較，cP<0.05；與SP組比較，eP<0.05

與Sham組比較，aP<0.05，bP<0.01；與I/R組比較，cP<0.05；與SP組比較，eP<0.05

4 討論

AMPK是一個復雜的異源性三聚體絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，一個催化亞基α亞基，兩個調節亞基β亞基和γ亞基。其α亞基172位蘇氨酸的磷酸化結合后可以激活AMPK的活性。多種病理和生理狀態下如缺血低氧、運動、AMP/ATP比例的升高以及促炎因子等，均可以使AMPK磷酸化激活[12-13]。激活的AMPK通過多種途徑促進ATP的生成以及脂肪酸的氧化，因此AMPK一直被稱為細胞內能量調節器，在心肌I/R損傷中，已有研究證明激活的AMPK對心肌具有保護作用[5-6]，這與我們實驗研究結果一致，七氟烷后處理組心肌梗死范圍減少，具有心肌保護效應，同時 p-AMPK/t-AMPK蛋白表達上調；給予AMPK抑制劑Compound c后p-AMPK/t-AMPK蛋白表達受到抑制，心肌梗死范圍增加，心肌保護效應消失。

自噬是細胞內溶酶體降解長壽蛋白質及損傷的細胞器從而維持胞內穩態平衡的一種生物過程[14]。只有完整的自噬流形成自噬溶酶體才能發揮細胞保護作用[15]。自噬在正常情況下表達水平相對較低，在某些應激的情況下可使其激活適應應激反應，發揮保護作用。然而，研究發現在死亡的細胞內存在著大量的自噬體[16]，過量的自噬可以導致細胞的死亡(即Ⅱ型程序性死亡)。Kabeya等2000年研究發現LC3因能始終靶向定位于自噬體膜上直到與溶酶體溶合，是目前確認的唯一可信的自噬體標記物，LC3的水平在某種程度上反映了自噬小體的數量。P62是一種泛素結合蛋白,與蛋白質的泛素化密切相關，它參與多種細胞信號轉導調控及自噬過程[17]。自噬過程中，P62與泛素化的蛋白質結合，再與定位于自噬小體內膜上的 LC3-II 蛋白形成復合物，一同在自噬溶酶體內降解。因此，出現自噬時，在細胞質中P62蛋白不斷被降解；當自噬活性減弱、自噬功能缺陷時，P62蛋白會在細胞質中不斷累積，P62是反映自噬活性的標記蛋白之一，其含量間接反映自噬小體清除水平[18]。

已有研究發現缺血和再灌注兩個階段中自噬是持續進行的，吞噬包裹所形成的自噬泡需要與溶酶體結合消化才能形成完整的自噬過程(即完整的自噬流)，然而I/R破壞了其結合的過程，從而使得自噬泡大量的聚集最終導致自噬性死亡[9]。同時也有報道七氟烷后處理修復完整的自噬流，恢復再灌注期間溶酶體功能，發揮I/R心肌保護作用[19]。缺血期通過AMPK通路激活的自噬對心肌發揮保護作用，而再灌注時通過Beclin-1途徑激活的自噬則發揮出相反的作用[8]。近期有研究報道通過激活AMPK信號通路，保護自噬泡與溶酶體結合即自噬流，從而抑制再灌注期間細胞內ROS的生成和細胞死亡[20]。這與我們研究相符，七氟烷后處理上調p-AMPK/t-AMPK蛋白的表達，說明AMPK信號通路參與了七氟烷后處理保護機制，給予AMPK抑制劑Compound c后此保護作用消失；同時七氟烷后處理降低再灌注后自噬體標志性蛋白LC3和溶酶體功能損傷標志性蛋白P62的表達，說明七氟烷后處理可以修復再灌注后自噬流的破壞，對在體心肌I/R損傷發揮保護作用。此外，比較SP組和I/R組的結果發現，給予AMPK的抑制劑Compound c增加了LC3和P62蛋白的表達，這表明AMPK信號通路對細胞內自噬流具有重要的調節作用。

綜上所述，七氟烷后處理對大鼠在體心肌I/R損傷具有保護作用，其機制可能是通過激活AMPK信號通路，使AMPK磷酸化，從而保護了自噬流，促使自噬體與溶酶體結合，使得自噬發揮其消化降解代謝產物并循環利用的作用，對心肌I/R損傷產生保護作用，這對今后我們研究七氟烷后處理產生心肌保護作用的機制提供了新思路。