阿膠的半巢式-多重PCR鑒別方法研究

張慧，孫海新，*，許娜，黃金發(fā)，孫丕春

（1.山東世通檢測評價技術(shù)服務(wù)有限公司，山東青島266000；2.青島世通檢測技術(shù)研究院，山東青島266000）

阿膠的半巢式-多重PCR鑒別方法研究

張慧1，2，孫海新1，2，*，許娜1，2，黃金發(fā)1，2，孫丕春1，2

（1.山東世通檢測評價技術(shù)服務(wù)有限公司，山東青島266000；2.青島世通檢測技術(shù)研究院，山東青島266000）

采用半巢式-多重PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）法鑒別阿膠中是否摻雜有馬、豬和牛源性成分。首先采用液氮研磨法從阿膠中提取高質(zhì)量的DNA（脫氧核糖核酸），以通用引物P1和P2進行第一輪擴增，并將擴增產(chǎn)物作為第二輪PCR的模板；再以包含通用引物P1和4種物種（驢、馬、豬和牛）特異性引物A、B、C和D的混合引物進行第二輪多重PCR擴增；最后電泳檢測第二輪擴增產(chǎn)物，根據(jù)電泳條帶的分子量大小，判斷阿膠產(chǎn)品的動物原材料是否摻假。結(jié)果表明，采用本方法可觀察到不同動物DNA分子量之間的明顯差異，通過DNA電泳結(jié)果直接判斷阿膠產(chǎn)品中是否摻假。

半巢式-多重PCR法；阿膠；鑒別；通用引物；特異性引物

阿膠在中國有上千年的食用歷史，具有補血止血，滋陰潤肺的功效。它是驢皮熬制后形成的一種特殊中藥材，主要成分為膠原蛋白［1］。純正的阿膠必需來自百分百的驢皮，方能保證產(chǎn)品的營養(yǎng)功效。由于阿膠功效獨特，供不應(yīng)求，多地均出現(xiàn)假冒偽劣產(chǎn)品。這些劣質(zhì)膠多采用豬、牛、馬等動物皮、骨、結(jié)締組織熬制，用肉眼難以鑒別，常規(guī)的鑒別方法也難以區(qū)分，臨床使用后不僅達不到治療效果，反而會出現(xiàn)中毒現(xiàn)象［2-7］。

2002衛(wèi)生部發(fā)布的《關(guān)于進一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》，規(guī)定了阿膠既是食品又是藥品。阿膠在《中國藥典2010》有相關(guān)質(zhì)量規(guī)定：以驢皮熬制的膠為阿膠正品［1］。但作為食品和保健品，目前還沒有國家標(biāo)準(zhǔn)，這就造成阿膠監(jiān)管體系的滯后，同時也為阿膠造假提供了較大的空間。這些偽劣產(chǎn)品的存在嚴(yán)重干擾了市場正常秩序，損害消費者利益。為了取締和預(yù)防假冒偽劣阿膠產(chǎn)品，除了需要質(zhì)量監(jiān)管部門加大執(zhí)法力度，首要前提就是要具備科學(xué)可靠的檢測方法。

目前常見的阿膠真?zhèn)舞b別方法有：（1）免疫化學(xué)法：將阿膠通過偶聯(lián)劑與丙種球蛋白聯(lián)接，免疫青紫藍灰兔，使之產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，經(jīng)對流免疫電泳檢查該抗體與阿膠-人丙種球蛋白發(fā)生良好的免疫應(yīng)答，而其它動物皮膠或偽膠均無免疫應(yīng)答反應(yīng)［8］。（2）熱分析法：采用差示掃描量熱法對驢皮膠，黃牛皮膠和豬皮膠在四個溫度段的DSC曲線進行了分析，發(fā)現(xiàn)不同膠樣在不同溫度階段出現(xiàn)了異于其它膠的DSC特征曲線，且有較好的重現(xiàn)性［9］。（3）電泳法：利用等電聚焦電泳法對正品阿膠和3種偽品阿膠進行鑒別，發(fā)現(xiàn)各樣品都有清晰的等電聚焦電泳圖譜，此法不僅可以鑒別藥材真?zhèn)危€可以確定樣品中主要蛋白質(zhì)的等電點和成分含量［10-11］。（4）利用不同膠的圓二色光譜圖的明顯差異性來鑒別阿膠真?zhèn)危?2］。（5）采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對豬皮膠、牛皮膠和驢皮膠酶解產(chǎn)物進行分析，制作HPLC指紋圖譜，為阿膠鑒別提供依據(jù)等［13-16］，而采用分子生物學(xué)技術(shù)在基因水平上對產(chǎn)品是否可靠進行鑒別的技術(shù)少有報道，因此，本文研究了半巢式-多重PCR、通過PCR產(chǎn)物電泳條帶差異來鑒別阿膠真?zhèn)蔚姆椒ǎF(xiàn)將結(jié)果匯總?cè)缦隆?/p>

1　材料與方法

1.1試驗設(shè)備與材料

TC-96/H/G型PCR儀：杭州博日科技有限公司；DYY-11型凝膠電泳儀：北京六一機械廠；AlphaImager HP型Alpha凝膠成像系統(tǒng)：美國Alpha Inotech。

液氮：青島城陽長松氣體有限公司；研缽：北京金志業(yè)儀器設(shè)備有限公司；1.5 mL EP離心管：Crystalgen；TE裂解液、10%SDS溶液、RNA酶：Sigma；蛋白酶K、PCR酶、PCR Buffer：Takara；醋酸鉀溶液、酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1，體積比）溶液、異丙醇、乙醇：上海索萊寶生物科技有限公司；引物：Sangon Biotech。

1.24種動物（驢、馬、豬和牛）DNA提取［17］

1）稱取適量（0.2 g）的樣品，放入用液氮預(yù)冷的研缽中，向研缽中加入液氮，迅速研磨，直到樣品成細(xì)微的粉末狀，置于1.5 mL離心管中；

2）向上述離心管中加入600μL預(yù)冷的TE裂解液，然后再加入60 μL的10%SDS溶液和10 μL的蛋白酶K，55℃放置3 h～5 h；

3）將上述消化液降至室溫，加入無DNA酶的RNA酶10 μL，37℃放置0.5 h～1 h；

4）將樣品放置冷卻至室溫后加入200μL的醋酸鉀溶液，在振蕩器上劇烈振蕩20 s，使其充分混合，4℃下12 000 r/min離心5 min；

5）將上清液轉(zhuǎn)移到另一個1.5 mL離心管中，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1，體積比）溶液，充分混合后，12 000 r/min離心5 min，重復(fù)此步驟2次～3次，直到兩相間無明顯的變性蛋白質(zhì)；

6）取上清液，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻后12 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入1 mL 70%的乙醇溶液，顛倒離心管數(shù)次，12 000 r/min離心5 min。棄上清液，空氣中干燥DNA沉淀15 min；

7）將DNA溶解于30 μL TE（pH7.6）或者超純水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3引物設(shè)計

根據(jù)驢、馬、豬、牛4個物種線粒體同源序列設(shè)計半巢式-多重PCR的引物序列［18-20］。使用的引物包括第一輪PCR所使用的正向通用引物P1和反向通用引物P2，第二輪多重PCR使用的正向引物仍為P1，反向引物為A（驢）、B（馬）、C（豬）和D（牛）。引物P1和P2進行第一輪PCR反應(yīng)，可以同時擴增出4個目標(biāo)物種691 bp的同源序列作為第二輪多重PCR的模板。引物序列見表1。

表1　引物序列Table 1Primer sequences

1.4PCR條件和電泳條件

1.4.1PCR條件

1）引物濃度：引物P1、P2、A、B、C、D濃度均為1 μM；

2）多重PCR引物配比：P1∶A∶B∶C∶D=4∶1∶1∶1∶1（質(zhì)量比）。

表2　PCR反應(yīng)條件Table 2PCR reaction conditions

1.4.2電泳條件

1）DNA電泳條件：恒壓110 V，瓊脂糖凝膠濃度0.4，電泳時間40 min；

2）PCR產(chǎn)物電泳條件：恒壓110 V，瓊脂糖凝膠濃度1.0，電泳時間40 min。

1.5引物特異性驗證

以1.2所提取的4種動物皮DNA為模板、按照1.3反應(yīng)條件，用P1和P2作為引物進行第一輪PCR反應(yīng)，再取1μL反應(yīng)產(chǎn)物作為模板，使用P1、A、B、C和D混合引物進行第二輪多重PCR反應(yīng)，取10 μL產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，驗證引物特異性。

1.6阿膠DNA提取

阿膠為市售正品，參照1.2進行DNA提取。

1.7阿膠真?zhèn)舞b別

將1.6中所提取阿膠DNA分為三等份（5 μL），分別編為1號管、2號管、3號管，分別向1號管、2號管中加入等體積的牛DNA、馬DNA，3號管不添加任何外源DNA；另設(shè)4號管和5號管，4號管加入牛和馬DNA各5 μL，5號管中加入豬和牛DNA各5 μL。

將上述1～5號管中DNA稀釋50倍，取1 μL DNA做模板，加入1μM引物P1和P2各1μL，Taq酶0.5μL，10×Loading Buffer 1 μL，ddH2O 5.5 μL構(gòu)建成10 μL反應(yīng)體系進行第一輪PCR反應(yīng)，再取1 μL反應(yīng)產(chǎn)物作為模板，使用P1、A、B、C和D混合引物構(gòu)建10 μL反應(yīng)體系進行第二輪多重PCR反應(yīng)，取2 μL產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

2　結(jié)果與分析

2.14種動物（驢、馬、豬和牛）皮DNA提取

采用方法1.2所提取的動物皮DNA瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示，結(jié)果表明，4種動物皮DNA條帶清晰，所提取質(zhì)量較好，可以用作PCR模板。

2.2引物特異性

以4種動物皮中提取的DNA為模板，經(jīng)過兩輪PCR擴增，擴增產(chǎn)物的電泳圖如圖2所示，可以看出，PCR擴增產(chǎn)物電泳圖條帶清晰，條帶大小與1.3引物設(shè)計中的預(yù)期一致，表明引物特異性良好。

2.3阿膠DNA提取

圖1　動物皮DNA電泳圖Fig.1DNA electrophoresis of Animal skins

圖2　引物特異性電泳圖Fig.2DNA primer specificity electrophoresis M-Maker標(biāo)記

按照1.2中步驟提取阿膠DNA，從已提取好的DNA中各取1 μL，進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖3所示，阿膠DNA有拖帶情況，這應(yīng)該是阿膠經(jīng)過多次加工造成其DNA降解所致。

圖3　阿膠DNA電泳圖Fig.3DNA electrophoresis of gelatin

2.4阿膠真?zhèn)舞b別

圖4　半巢式-多重PCR電泳圖Fig.4Semi-nested multiplex PCR electrophoresis

阿膠真?zhèn)舞b別結(jié)果如圖4所示，可以看出，1號管中含有兩條明顯的電泳條帶，根據(jù)條帶大小判斷應(yīng)該為驢和牛兩種DNA成分；2號管中應(yīng)為驢和馬兩種DNA成分，3號管中應(yīng)為純正阿膠DNA，4號管中應(yīng)為牛和馬兩種DNA成分，5號管中應(yīng)為豬和牛兩種DNA成分，與預(yù)期結(jié)果一致，上述結(jié)果表明，本研究采用的半巢式-多重PCR法可以有效鑒別阿膠中是否摻雜有馬、豬和牛源性成分，具有較好的準(zhǔn)確性和專屬性。

3　討論

隨著人們生活水平的提高，阿膠的市場需求量逐年迅速增加，同時對阿膠的質(zhì)量要求也越來越嚴(yán)格。目前，雖然在阿膠真?zhèn)舞b別方面已經(jīng)建立了多種方法，并在生產(chǎn)實踐中較好地發(fā)揮了作用，但這些方法均有自身的局限性。目前較先進的鑒定方法是分子生物學(xué)法，即基于DNA的分子技術(shù)來進行物種鑒定，因為DNA組成是物種最根本、最穩(wěn)定的。目前，有關(guān)阿膠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還不完善，GenBank等核酸數(shù)據(jù)庫中有關(guān)驢的基因序列數(shù)目較少，國內(nèi)外對阿膠的研究也相對較少，應(yīng)引起我們的重視，加強對阿膠鑒別的分子生物學(xué)研究，重點在于提高方法的標(biāo)準(zhǔn)性、實用性和批量性。

本研究就是以高度保守穩(wěn)定的線粒體細(xì)胞色素B基因為基礎(chǔ)設(shè)計引物，采用半巢式-多重PCR法鑒別阿膠中是否摻雜有馬，豬和牛源性成分，經(jīng)驗證效果良好。基于市場上阿膠存在單一成分和多種成分摻假的現(xiàn)象，在研究過程中采用添加外源DNA的方法，即添加單一外源DNA和兩種外源DNA相結(jié)合的方式，模擬摻假劣質(zhì)阿膠，通過半巢式-多重PCR法鑒別，能夠清楚分辨所添加的源性成分，實現(xiàn)快速、直讀判斷，具有較強的實用性。當(dāng)然，從建立該檢驗方法的理論完整性、科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)性等方面考慮，還需將最終PCR產(chǎn)物進行測序，這需要在后續(xù)工作中作進一步的完善。

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Study on Semi-nested Multiplex PCR Identification Method of Gelatin

ZHANG Hui1，2，SUN Hai-xin1，2，*，XU Na1，2，HUANG Jin-fa1，2，SUN Pi-chun1，2
（1.Shandong Seatone Detection and Evaluation of Technical Services Ltd.，Qingdao 266000，Shandong，China；2.Qingdao Seatone Institute of Detection and Technology，Qingdao 266000，Shandong，China）

In this study，semi-nested multiplex PCR method were used to identify whether gelatin doped with horses，pigs and cattle-derived ingredients.Firstly，liquid nitrogen grinding method was used to extract high quality DNA from gelatin.Universal primer P1 and P2 were used for the first round of amplification，and the amplified product was used as the templates of the second round PCR.Then mixed primers containing universal primer P1 and specific primers（A，B，C and D）was used to do multiplex PCR amplification of second rounds. Final the second round of amplification products with electrophoresis was detected，and authenticity of gelatin was determined according to molecular weight of the electrophoretic bands.The results showed that it can observe the significant differences of the DNA molecular weight of different animals with the method and directly judge whether gelatin is adulterated by DNA electrophoresis results.

semi nested-multiplex PCR method；gelatin；identification；universal primer；specific primers

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.024

2015-10-13

國家火炬計劃項目（2015GH581533）；青島市技術(shù)創(chuàng)新平臺建設(shè)計劃項目（14-7-2-36-gx）

張慧（1987—），女（漢），助理工程師，碩士，研究方向：微生物與生化藥學(xué)。

孫海新（1978—），男，高級工程師，博士，研究方向：食品科學(xué)。